SSEA-4在不同分期卵巢腺癌中表達(dá)及與化療耐藥和預(yù)后相關(guān)性

劉忠杰 宋永禎 王菲 范鳳霞 王靜 趙寧 畢鳳玲 李桂芬

(衡水市人民醫(yī)院 1婦科，河北 衡水 053000；2體檢科；3衡水市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科)

卵巢癌(EOC)早期患者可達(dá)到90%的5年生存率，晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移的EOC患者僅29%生存率〔1,2〕。同時(shí)因該病具有早期癥狀不明顯等特點(diǎn)且卵巢位于盆腔深部，故70%EOC患者確診即為晚期，因此EOC具有占婦科惡性腫瘤首位的病死率，對(duì)女性健康具有嚴(yán)重威脅〔3,4〕。近10年隨著手術(shù)治療聯(lián)合化療治療方案的應(yīng)用，死亡率并未得到顯著改善，多藥耐藥性是其中一項(xiàng)重要原因。研究表明約25%的卵巢腺癌患者發(fā)生原發(fā)性耐藥，75%發(fā)展繼發(fā)性耐藥，因此尋找卵巢腺癌耐藥性的特異性生物指標(biāo)是急需解決的問題〔5,6〕。且EOC的發(fā)生發(fā)展受多基因共同決定，其的病情評(píng)估、早期篩查及預(yù)后判斷亦需要較靈敏的腫瘤標(biāo)記物。階段特異性胚胎抗原(SSEA)-4是存在于胚胎干細(xì)胞(ESCs)及內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞(INC)表面〔7〕，多糖抗原的一種，可作為未分化細(xì)胞的表面標(biāo)志〔8〕，近年來多研究表明乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與SSEA-4密切相關(guān)〔9,10〕，但卵巢腺癌與SSEA-4的相關(guān)研究尚缺少證據(jù)。本研究探討不同分期的卵巢腺癌中SSEA-4表達(dá)及其與化療耐藥和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 以2012年1月至2016年1月衡水市人民醫(yī)院收治的卵巢腺癌患者155例，所有患者經(jīng)病理學(xué)確診后行手術(shù)治療且術(shù)前未經(jīng)其他治療，術(shù)后行化療。入選患者按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)分組：Ⅰ～Ⅱ期組(57例)、Ⅲ期組(75例)、Ⅳ期組(23例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有完整的臨床及隨訪資料；②無既往婦科手術(shù)史；③無既往放化療、免疫治療史且如愿親未接受過抗腫瘤藥物治療；④術(shù)后采取正規(guī)化療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有慢性或代謝病者；②其他惡性腫瘤或者影響本研究的其他生殖系統(tǒng)疾病。本研究通過倫理審批，且所有患者簽署知情同意書。

1.2免疫組化(SP)法檢測(cè)組織中SSEA-4表達(dá) 所有患者行手術(shù)治療，取病灶組織。運(yùn)用SP法對(duì)組織內(nèi)SSEA-4表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，通用型SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人SSEA-4抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。具體步驟：甲醛對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定后用石蠟包埋。切4 μm厚度薄片后使用梯度酒精及二甲苯進(jìn)行脫蠟， 15 min H2O2處理組織切片，后進(jìn)行微波抗原修復(fù)，再自然降溫封閉后，抗人1∶50稀釋的多克隆SSEA-4抗體滴加，4℃過夜。通用型二抗工作液滴入，37℃條件下30 min；后SP工作液滴加，37℃條件下15 min；后運(yùn)用AEC進(jìn)行顯色，蘇木素進(jìn)行復(fù)染后封片。閱片采用雙盲方法。

1.3判讀標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)陽性著色程度積分綜合計(jì)算：1分：弱陽性(+)；2分：中等陽性()；3分：強(qiáng)陽性()。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)賦分如下：1分：<25%的細(xì)胞呈弱陽性(+)數(shù)；2分：25%～49%的細(xì)胞呈中等陽性()數(shù)；3分：≥50%的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性()數(shù)。上述兩者乘積<3為陰性，≥4為陽性，共觀察5個(gè)高倍鏡視野(HP)后取平均。

1.4化療療效評(píng)定 本研究采用鉑類+紫杉醇行的EOC一線化療方案系統(tǒng)治療所有患者，間隔21 d每療程，所有患者6～8個(gè)療程，在停止化療4 w以上對(duì)患者進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。根據(jù)B超、CT或二次探查術(shù)結(jié)合盆腔檢查、腹部檢查、腫瘤標(biāo)記物水平〔糖類抗原(CA)125、癌胚抗原(CEA)、CA199等〕進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。化療療效標(biāo)準(zhǔn)〔3〕：完全緩解(CR)：腫瘤完全消失至少4 w；為部分緩解(PR)：腫瘤縮小>50%且疾病至少4 w無進(jìn)展；穩(wěn)定(SD)：至少4 w腫瘤縮小≤50%，腫瘤增大≤25%；疾病進(jìn)展(PD)出現(xiàn)新病灶或腫瘤增大>25%。在第6或第8個(gè)療程結(jié)束后對(duì)患者進(jìn)行化療反應(yīng)評(píng)價(jià)：化療無效：SD+PD；化療有效：CR+PR。以下情況出現(xiàn)即為化療耐藥：①臨床癥狀在初次化療后未消失，有包塊通過B超和盆腔檢查，未有下降至正常臨床證實(shí)緩解狀態(tài)的血清CA125；②短期內(nèi)有效在初次化療后但復(fù)發(fā)出現(xiàn)在化療結(jié)束后6個(gè)月以內(nèi)的相對(duì)較短時(shí)間。

1.5隨訪 患者治療后達(dá)到臨床CR后定期進(jìn)行門診復(fù)查，生存期以電話形式進(jìn)行隨訪。復(fù)發(fā)為半年后出現(xiàn)以下現(xiàn)象：胸腹水、腫瘤標(biāo)記物、不明原因腸梗阻或影像學(xué)檢查或查體發(fā)現(xiàn)腫塊、隨訪率為100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析或χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同分期及SSEA-4表達(dá)的卵巢腺癌患者一般資料比較 不同分期卵巢腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移及腹水差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同腹水及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況SSEA-4陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同分期及SSEA-4表達(dá)患者一般資料比較〔n(%)〕

2.2SSEA-4在不同分期卵巢腺癌組織中表達(dá)情況 SSEA-4在Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期卵巢腺癌中陽性表達(dá)〔34例(59.65%)、64例(85.33%)、22例(95.65%)〕差異顯著(χ2=17.674，P=0.000)。見圖1、圖2。

圖1 SSEA-4在卵巢腺癌中陽性表達(dá)(HE染色，×100)

圖2 不同分期SSEA-4蛋白在卵巢腺癌中表達(dá)

2.3SSEA-4表達(dá)與近期化療反應(yīng)的關(guān)系 SSEA-4陰性表達(dá)組化療有效及化療敏感性顯著高于SSEA-4陽性組(P<0.001)。見表2。

表2 SSEA-4表達(dá)與近期化療反應(yīng)的關(guān)系〔n(%)〕

2.4不同預(yù)后患者SSEA-4表達(dá)水平比較 SSEA-4陽性表達(dá)患者死亡及復(fù)發(fā)〔69例(95.83%)〕較SSEA-4陰性表達(dá)患者〔3例(4.17%)〕顯著偏高(χ2=29.403，P=0.000)，即SSEA-4陽性表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。

2.5不同SSEA-4表達(dá)患者生存率比較 SSEA-4陽性組3年生存率、5年生存率顯著低于SSEA-4陰性組(P<0.05)，1年生存率差異無統(tǒng)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同SSEA-4表達(dá)患者生存率比較〔n(%)〕

2.6SSEA-4表達(dá)與不同卵巢腺癌分期患者化療情況及預(yù)后的相關(guān)性 SSEA-4陽性表達(dá)、不同卵巢腺癌分期與患者化療有效、耐藥性、復(fù)發(fā)均呈顯著正相關(guān)(P<0.05，P<0.001)，見表4。

表4 SSEA-4表達(dá)與患者分期及預(yù)后的相關(guān)性

3 討 論

卵巢惡性腫瘤發(fā)病率居于婦科惡性腫瘤中第3位，僅次于宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌，具有發(fā)病隱匿、易侵襲、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，近年來發(fā)病越來越趨于年輕化〔11，12〕。5年生存率僅為20%～30%，居?jì)D科腫瘤死亡率第1位〔13〕，究其死亡率高的原因可能為如下兩方面：一是缺乏早期篩查、病情評(píng)估及預(yù)后判斷的指標(biāo)，大部分患者確診即為中晚期〔14〕；二是腫瘤的化療耐藥性〔15〕?？梢娨陨蟽牲c(diǎn)是領(lǐng)域內(nèi)關(guān)于疾病發(fā)生發(fā)展的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。SSEA-4作為女性惡性腫瘤中具有明顯異常表達(dá)的指標(biāo)〔16〕，其在卵巢癌患者中亦存在異常表達(dá)〔16〕，但兩者在不同分期卵巢腺癌中的表達(dá)研究及對(duì)預(yù)后及化療耐藥性的反應(yīng)價(jià)值仍相對(duì)較不足〔17〕。

有研究表明，EOC發(fā)生的誘因可能是長(zhǎng)期的不間斷排卵〔18〕，本研究結(jié)果與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果相一致〔19〕，提示卵巢腺癌的發(fā)生可能和絕經(jīng)及妊娠次數(shù)無關(guān)。SSEA-4在腫瘤環(huán)境的發(fā)展或維持中具有潛在作用〔20〕，SSEA-4也被證明在乳腺和卵巢腫瘤的化療耐藥和腫瘤干細(xì)胞群體中表達(dá)〔21〕，這與本研究結(jié)果類似。提示SSEA-4可能參與了卵巢腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，與腫瘤轉(zhuǎn)移及腹水密切相關(guān)，這與大部分以往研究結(jié)果相一致〔22,23〕。其機(jī)制可能與SSEA-4參與人原始生殖細(xì)胞(PGCs)的自我更新、增殖及多向分化有關(guān)，而PGC遷移到未來的性腺嵴，在那里它們隨著性腺進(jìn)行性別決定而定居。在性腺中，PGC分化為雄性生殖腺、雄性生殖腺或雌性生殖腺〔24〕。分析SSEA-4與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系可能與其對(duì)PGCs的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究中相關(guān)性分析結(jié)果提示，SSEA-4的表達(dá)狀態(tài)可作為患者對(duì)化療耐藥性及預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。且多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道SSEA-4表達(dá)與多種癌癥的化療藥物療效具有顯著相關(guān)性，可作為預(yù)后指標(biāo)之一〔25,26〕。關(guān)于SSEA-4對(duì)耐藥性的影響，有可能因?yàn)镾SEA-4在控制細(xì)胞增殖及凋亡的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)了其耐藥性等因素的影響，其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步基礎(chǔ)研究明確。

綜上，SSEA-4在卵巢腺癌中的表達(dá)與腫瘤分期顯著相關(guān)，其在不同分期卵巢腺癌中的差異性表達(dá)可能參與了卵巢腺癌的發(fā)展過程，可作為卵巢腺癌惡行程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。SSEA-4與患者化療耐藥及預(yù)后顯著相關(guān)，其表達(dá)強(qiáng)度可有效反映患者對(duì)化療的敏感程度，可作為化療耐藥及預(yù)后的指標(biāo)，可能成為卵巢腺癌腫瘤惡性程度、近期化療療效及遠(yuǎn)期預(yù)后的有效指標(biāo)。