老年甲狀腺乳頭狀癌患者超聲造影特征與BARF V600E突變的相關性

張靜 李宏英 李輝

(天水市第一人民醫院超聲科，甘肅 天水 741000)

乳頭狀癌(PTC)是甲狀腺癌中最常見的病理學類型，占甲狀腺所有惡性腫瘤的80%～85%。目前研究〔1〕已明確，除了患者年齡、性別、局部浸潤及淋巴結和遠處轉移外，鼠類肉瘤濾過性毒素菌致癌同源體B1(BRAF)基因V600E突變亦被證實是甲狀腺PTC預后不良的危險因素。BRAF V600E突變陽性的PTC生物學行為較BRAF V600E突變陰性的PTC更為惡劣，其局部復發率和遠處轉移風險更大〔2〕。目前超聲檢查聯合細針穿刺細胞學是明確甲狀腺結節性質的常用手段。研究〔3〕表明，超聲造影(CEUS)相較于常規超聲檢查更能提示結節的性質和判斷其生物學行為。然而，CEUS與PTC結節BARF V600E突變的相關性尚不明確。本研究主要探討老年PTC患者CEUS結果與BARF V600E突變的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象 納入2018年10月至2021年10月天水市第一人民醫院確診的157例老年PTC患者。納入標準：(1)細胞學或術后病理明確診斷為PTC；(2)首次確診，既往無其他甲狀腺疾病或手術史。排除標準：(1)年齡<60歲；(2)未行病理學檢查或病理提示為其他類型甲狀腺腫瘤，如濾泡狀癌；(3)無相應BARF V600E突變檢測結果；(4)合并其他甲狀腺疾患，如甲狀腺功能亢進、橋本甲狀腺炎等；(5)存在嚴重心力衰竭或肝腎功能不全等CEUS禁忌證；(6)CEUS圖像質量差或對造影劑過敏。

1.2研究方法 通過電子病歷系統收集所納入患者的臨床和超聲檢查結果資料，包括患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤是否多灶性及是否分布于雙葉。若患者存在多個PTC結節，則以行BARF V600E突變所對應的結節為準納入分析。

患者取臥位，頸部過伸，充分暴露甲狀腺后首先行常規超聲檢查探視每個甲狀腺結節。隨后使用Bracco公司超聲造影劑聲諾維外周靜脈注射行CEUS檢查，超聲儀器為東芝 Aplio 400彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率 7.5～13.0 MHz。經肘靜脈快速推注2 ml造影劑，隨后以5 ml生理鹽水沖管，立即開啟儲存，動態觀察3 min。CEUS均由一名經驗豐富的超聲醫師操作和解讀。從常規超聲和CEUS結果中提取有關結節信息，① 結節形態：規則vs 不規則；②邊界：清晰 vs 不清晰；③是否為低回聲；④縱橫比；⑤是否有微鈣化；⑥血流信號：多vs少；⑦造影后結節大小：增大 vs 無變化；⑧增強均勻度和增強程度；⑨增強方式：向心性vs彌散性；⑩增強時間：同步或快進 vs 慢進；廓清時間：同步或慢消 vs 快消。由細針穿刺細胞學或術后病理明確PTC診斷。從細針穿刺或外科手術標本中提取基因組DNA，并使用實時熒光定量PCR法進行擴增。前向和反向引物分別為5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′和5′-GGCCAAAAATTTAATCA-GTGGA-3′。通過實時監測擴增反應中各循環擴增產物量，最終通過得到的Ct值及標準曲線對其進行定量分析。利用Sanger測序法明確是否存在BARF V600E突變。

1.3統計學分析 應用SPSS25.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、多因素二元Logistic回歸分析。使用受試者工作特征(ROC)曲線明確變量鑒別BRAF V600E突變與否的最佳切割值、曲線下面積(AUC)及敏感度和特異度。

2 結 果

2.1BARF 600E突變組與BARF 600E野生組臨床特征比較 86例(54.78%)存在BRAF V600E突變。BRAF V600E突變組與野生組年齡、性別構成、腫瘤直徑、腫瘤多灶性分布及雙葉分布差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 BRAF V600E突變組與非突變組臨床特征比較

2.2BARF 600E突變組與野生組常規超聲和CEUS特征比較 同BARF V600E野生組相比，BARF V600E突變組結節縱橫比≥1、微鈣化、造影后結節增大、向心性增強及增強時間為同步或快進的比例均顯著升高(均P<0.01)。見表2。

表2 BRAF V600E突變組與野生組常規超聲和CEUS特征比較〔n(%)〕

2.3BARF V600E突變的多因素分析 縱橫比≥1、微鈣化及造影后結節大小增大與BRAF V600E突變率升高有關(P<0.01，P<0.001)。見表3。

表3 常規超聲和CEUS特征與結節BRAF V600E突變的多因素分析結果

2.4BRAF V600E突變模型 根據表3中的回歸系數，BRAF V600E突變的模型，其中縱橫比≥1賦值1分，縱橫比<1賦值0分，有微鈣化賦值2分，無微鈣化賦值0分，造影后結節增大賦值2分，造影后結節無變化賦值0分。

2.5模型效能評估 ROC曲線顯示，當模型總分>2分時，該模型預測結節BRAF V600E突變的AUC為 0.83(95%CI：0.76～0.88)，敏感性為88.4%(95%CI：79.7%～94.3%)，特異性為60.6%(95%CI：48.3%～72.0%)。見圖1。

圖1 所構建模型預測結節 BRAF V600E突變的ROC曲線

3 討 論

隨著超聲篩查的普及，我國甲狀腺癌特別是微小PTC癌的發病率劇增〔4〕。普遍認為PTC臨床病程惰性，預后良好，僅有極少部分患者發生遠處轉移和腫瘤性死亡。BRAF基因位于7號染色體，其中的V600E突變即為該基因15號外顯子上第600位纈氨酸突變為谷氨酸。有研究〔5〕表明，BRAF V600E突變率為60%～70%，突變陽性的甲狀腺PTC生物學行為更為惡性。

超聲是評估甲狀腺結節良惡性、規劃手術方案及術后檢測的一線檢查手段。現已明確〔6〕，PTC常規超聲圖像特征為低回聲結節，邊界不清，形態多不規則，縱橫比≥1，且結節內常伴微鈣化。一包含31項研究、共計18 288個甲狀腺結節的薈萃分析〔7〕發現目前常規超聲診斷PTC的準確率可高達74%～82%。CEUS是通過靜脈注射造影劑來實時、間接反映組織和器官血流分布和血流灌注特征的成像方式。超聲-病理對照研究〔8〕發現，CEUS的定量參數如達峰強度、達峰時間等與腫瘤的微循環密度顯著相關，而甲狀腺惡性結節靜脈竇密度顯著高于良性結節，為CEUS評估甲狀腺結節提供了堅實基礎。研究〔9〕表明，CEUS鑒別甲狀腺良惡性結節的敏感性為97.73%，特異性為89.47%。

目前有關超聲圖像特征與BRAF V600E突變間的關系尚不十分明確。本研究多因素分析中，縱橫比≥1、微鈣化和造影后結節增大與BRAF V600E突變關系密切。Li等〔10〕研究表明，BRAF V600E突變陽性結節聲像學特征與野生型結節并無明顯區別，即常規超聲特征無法用于明確該基因是否突變；然而，Kabaker等〔11〕研究發現，縱橫比≥1、邊界不清、低回聲、微鈣化及無暈這5個聲像特征中存在≥3個，則其對BRAF V600E突變的陽性預測率為82%，與本研究結論相類似。Lin等〔12〕研究發現，向心性增強方式和低增強是BRAF V600E突變結節的CEUS特征，但其敏感性和特異性僅為68.3%和40.0%。現有文獻報道爭議較大可能與研究人群種族、特征及所使用的研究方案等因素有關。

本研究顯示，造影后結節增大是BRAF V600E突變在CEUS中的聲像學特征。一般認為造影后結節增大反映腫瘤呈浸潤性生長〔13〕。BRAF V600E突變能夠增加激酶的活性，繼而導致絲裂原活化蛋白激酶通路持續性活化，促進腫瘤生長和進展〔14〕。有學者利用超聲彈性成像發現BRAF V600E突變的甲狀腺結節硬度更高〔15〕，這可能也是突變陽性結節微鈣化比例更高的原因。

本研究通過構建了評分系統來預測BRAF V600E突變的風險。ROC曲線結果提示，當縱橫比≥1、微鈣化和造影后結節增大3個特征中存在至少2個特征對BRAF V600E突變預測的敏感性較高，但特異性較低。本研究為單中心、回顧性研究，且僅分析了CEUS的定性主觀指標，難以克服主觀因素的影響，這些因素均有可能限制了模型的效能。

綜上，縱橫比≥1、微鈣化、造影后結節增大3個特征與BRAF V600E突變相關。據此構建的模型對預測BRAF V600E突變有較高的效能。