基于PI3K/Akt信號通路探究電針對帶狀皰疹后遺神經痛大鼠神經功能的干預機制

陳可 武彩花 鄭俊 詹志丹

(1武漢市中西醫結合醫院針灸科,湖北 武漢 430033;2湖北日報傳媒集團衛生所)

帶狀皰疹后遺神經痛為帶狀皰疹較常見的并發癥，屬于頑固性神經病理性疼痛疾病，主要癥狀多為自發痛、誘發痛、痛覺過敏等，病程大多遷延反復，臨床治療難度較大，在一定程度上影響患者的日常生活和工作〔1〕。目前隨著臨床上對帶狀皰疹后遺神經痛的不斷研究發現，常規西醫治療效果不理想，多數研究致力于中醫針灸治療，電針已經用于此病的治療，但并未有研究明確其作用機制〔2〕。報道顯示，神經痛的發生與多信號轉導通路相關，其中研究最為廣泛的為磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路，此通路可介導周圍神經系統痛覺過敏，誘發并維持神經痛〔3〕。基于上述背景，在本文研究中旨在分析電針對帶狀皰疹后遺神經痛大鼠脊髓神經功能PI3K/Akt信號通路的影響，明確電針治療帶狀皰疹后遺神經痛的機制，為臨床上電針在此病中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 選取60只SFP級雄性大鼠，購自冠科生物技術(中山)有限公司，動物許可證號：SYXK(粵)2020-0240，6～8周齡，體質量200～250 g，在相對濕度為30%～35%、溫度為(23.8±1.5)℃下飼養 7d，每日光照24 h，明暗周期為12 h。本次試驗操作均嚴格參照動物實驗倫理要求相關規定進行，且獲得醫院倫理委員會審批同意。

主要儀器及試劑：CV-1細胞(美國Invitrogen公司)，水痘帶狀皰疹病毒(西安市疾病控制中心)，Von Frey型電子測痛儀(美國Stoelting公司)，BME-410A型熱痛刺激儀(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)，穴位刺激儀(南京濟生醫療科技有限公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、兔抗人p-PI3k抗體、小鼠大鼠p-Akt抗體(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組及建模 將所購買的60只大鼠隨機分為A、B、C、D組各15只，A組不做任何處理，正常喂養，B、C、D組均參照Zhang等〔4〕研究建立帶狀皰疹后遺神經痛大鼠模型，將CV-1細胞加入至DMEM/F12完全培養基中制備成為細胞懸液，以5.0×104/cm2的濃度接種在培養瓶中，之后使用水痘帶狀皰疹病毒感染CV-1細胞，當80%的CV-1細胞被感染后收集并制備細胞懸液，行水痘帶狀皰疹病毒接種，將50 μl病毒注射于大鼠右足蹼底部，4 d后測定機械痛敏閾值、熱痛敏閾值，降低表示建模成功。

1.2.2機械痛敏閾值、熱痛敏閾值測定 在B、C、D組大鼠感染4 d后，分別對四組大鼠做機械痛敏閾值、熱痛敏閾值測定，使用美國Stoelting公司Von Frey型電子測痛儀測定機械痛敏閾值，使用中國醫學科學院生物醫學工程研究所BME-410A型熱痛刺激儀測定熱痛敏閾值，以判定B、C、D組是否建模成功，最終B、C、D組大鼠均建模成功，行后續研究。

1.2.3干預 A組不做任何處理，進行正常喂養；B組使用生理鹽水灌胃；C組使用27 mg/(kg·d)的普瑞巴林灌胃，1次/d，干預1 w；D組行電針干預。皮膚局部消毒，采用一次性無菌針灸針(0.18 mm×25.00 mm)刺入大鼠夾脊、局部阿是、心俞、膽俞，連接穴位刺激儀，施用不同頻率(2～15 Hz)，進行約30 min刺激，其刺激深度大約為4.00 mm，0.5 h后出針，1次/d，干預1 w。

1.2.4機械痛敏閾值、熱痛敏閾值測定 在上述干預結束后次日測定四組大鼠機械痛敏閾值、熱痛敏閾值。

1.2.5樣本采集 在機械痛敏閾值、熱痛敏閾值測定完成后參照動物實驗倫理要求相關規定對大鼠行麻醉后處死，迅速取脊髓組織，均勻分為4等份，其中1等份做脊髓組織懸液，2等份做組織切片，1等份在液氮中保存備用。

1.2.6脊髓組織神經遞質測定 采用脊髓組織中神經遞質P物質(SP)、神經激肽(NK)-1評價大鼠脊髓神經功能，取所制備的脊髓組織懸液，采用ELISA測定，將ELISA檢測試劑盒放置于室溫下做平衡20 min處理，之后將不同濃度的50 μl標準品加入至標準孔中，將50 μl待測樣品加入至樣本孔中，每孔中加入100 μl的辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，密封反應孔，在溫度為37℃的環境下孵育1 h，將上清液棄除后加入350 μl洗滌液，在室溫環境下孵育1 min，棄除上清液，重復上述步驟5次，之后將50 μl底物A、底物B加入至每孔中，37℃孵育15 min，之后終止反應，獲得SP、NK-1水平。

1.2.7脊髓神經元形態變化檢測 取脊髓組織切片，做蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察各組大鼠脊髓神經元形態變化。

1.2.8脊髓神經元凋亡檢測 取脊髓組織切片，采用TUNEL染色法測定大鼠脊髓神經元凋亡情況。

1.2.9PI3K/Akt信號通路檢測 取液氮中保存的脊髓組織，采用Western印跡法測定大鼠脊髓組織PI3K/Akt信號通路蛋白表達量，提取組織總蛋白，取20 μg蛋白質樣本，電泳1.5 h后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在室溫下做封閉處理，之后分別加入1∶1 000 Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)給予稀釋的PI3K/Akt信號通路蛋白p-PI3k、p-Akt一抗，使用1∶2 500的辣根過氧化氫酶標記的二抗在室溫下孵育處理，電化學發光(ECL)法顯色，使用Labwork凝膠圖像掃描所獲得膠片，以磷酸甘油醛脫氧酶(GAPDH)為內參，計算p-PI3k、p-Akt蛋白表達量。

1.3統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行levene法檢測、shapiro-wilk檢驗、方差分析、方差齊性檢驗及t檢驗。

2 結 果

2.1模型是否建立成功鑒定 B、C、D組機械痛敏閾值、熱痛敏閾值顯著低于A組(P<0.05)，說明模型建立成功。見表1。

2.2干預結束后各組機械痛敏閾值、熱痛敏閾值對比 B、C、D組機械痛敏閾值、熱痛敏閾值顯著低于A組(P<0.05)；D組機械痛敏閾值、熱痛敏閾值顯著高于B、C組(P<0.05)。見表1。

2.3干預結束后各組脊髓組織神經遞質對比 B、C、D組SP、NK-1顯著高于A組(P<0.05)；D組SP、NK-1顯著低于B、C組(P<0.05)。見表1。

2.4干預結束后各組脊髓神經元形態變化分析 A組脊髓神經元形態正常。B組脊髓神經元壞死，細胞碎片增多，細胞腫脹。C、D組較B組脊髓神經元細胞腫脹數減少，出現正常神經細胞，神經元壞死被修復，D組改善更為顯著。見圖1。

表1 各組干預前后機械痛敏閾值、熱痛敏閾值、脊髓組織神經遞質、脊髓神經元凋亡、脊髓組織PI3K/Akt 信號通路蛋白表達量對比

圖1 干預結束后各組脊髓神經元形態(HE,×400)

2.5干預結束后各組脊髓神經元凋亡情況對比 B、C、D組凋亡指數顯著高于A組(P<0.05)；D組凋亡指數顯著低于B、C組(P<0.05)。見表1。

2.6干預結束后各組脊髓組織PI3K/Akt信號通路蛋白表達量對比 B、C、D組p-PI3k、p-Akt蛋白表達量顯著高于A組(P<0.05)；D組p-PI3k、p-Akt蛋白表達量顯著低于B、C組(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組PI3K/Akt信號通路蛋白

3 討 論

帶狀皰疹后遺神經痛屬于一種與脊髓、脊髓上中樞、外住神經敏化相關的神經疼痛，此病多發于老年人群，目前臨床上多采用鎮痛藥物進行治療，但效果并不理想，且長期用藥多伴隨著不同程度的不良反應〔5,6〕。

中醫學上將帶狀皰疹后遺神經痛歸于“蛇串瘡”“纏腰火丹”等范疇，認為此病的病因多為內傷情志、肝郁氣滯、正氣不足、邪毒外感等所致，不通則痛〔7〕。中醫認為針灸可用于治療此病，認為經針刺對應穴位，發揮溫通經脈、促使血氣運行，血氣運行則可發揮其通而不痛的作用，電針屬于針灸的一種，用于治療此病有效〔8,9〕。研究顯示，針刺夾脊穴可調節督脈、足太陽經脈、全身的陽氣，達到調節臟腑經絡的作用〔10〕。目前臨床上已有多數研究將電針應用于帶狀皰疹后遺神經痛的治療中〔11,12〕，且已經取得了良好的成效，但并未有研究明確其具體作用機制，本研究結果顯示，經電針干預的大鼠疼痛明顯減輕，疼痛閾值提高，提示電針治療有效。

研究顯示，PI3K/Akt信號通路可介導痛覺過敏，參與神經痛的中樞敏化，在機體處于正常狀態下時其在細胞、組織中的含量較少，但在外界信號的刺激下PI3K/Akt信號通路被激活，PI3k、Akt蛋白含量明顯增多，可介導痛覺的產生〔13～15〕。目前臨床上關于PI3K/Akt信號通路與神經痛的研究較少，周學龍等〔16〕在其研究中認為PI3K/Akt信號轉導通路可經EphB受體介導大鼠神經病理性痛，另外陳歡等〔17〕在其研究中認為紫杉醇所誘發的神經痛與PI3K/Akt信號轉導通路相關。目前臨床上多采用神經遞質含量評估神經功能，包括SP、NK-1等，其中SP具有雙重作用，其一方面可產生疼痛，另一方面可傳遞痛覺信息，參與信號轉導，而NK-1與SP密切相關，SP可經作用于帶狀皰疹后遺神經痛脊髓NK-1受體，在神經刺激下，兩者相結合，共同傳遞痛覺信息，在帶狀皰疹后遺神經痛中發揮著重要的作用〔18～20〕。本文進一步分析電針有效減輕帶狀皰疹后遺神經痛大鼠疼痛的作用機制，分析大鼠脊髓神經遞質、神經元及PI3K/Akt信號通路變化，結果顯示，電針干預的大鼠脊髓組織中神經遞質表達異常情況明顯改善，神經元形態恢復正常，PI3K/Akt信號通路被抑制。這一結果顯示，電針可能經調控PI3K/Akt信號通路，作用于脊髓神經功能，改善神經遞質異常表達，減少神經元凋亡，而提高疼痛閾值。雖然本文上述結果顯示，電針與帶狀皰疹后遺神經痛大鼠脊髓神經功能、PI3K/Akt信號通路相關，但目前并未有研究顯示上述關系，且本次研究動物數量較少，因此本文上述結果還需后續研究進一步分析證實，以明確電針治療帶狀皰疹后遺神經痛的作用機制。