β微球蛋白和花生四烯酸代謝物對老年大鼠慢性腎臟疾病炎癥反應的影響

馮靜 李莉

(1海口市人民醫院，海南 海口 570208，2海南醫學院第一附屬醫院)

不同程度腎功能損害是慢性腎衰竭的主要病因，炎癥細胞可以產生大量的炎癥介質，炎癥介質又可趨化、激活炎癥細胞〔1〕。炎癥介質可通過收縮或舒張血管影響腎臟局部的血流動力學，通過影響細胞的增殖、自分泌和旁分泌，從而介導炎癥損傷及其硬化病變〔2〕。持續炎癥狀態會參與慢性腎部疾病的足細胞損傷，隨著病情的加重，炎癥狀態就嚴重，并且能夠增加心血管疾病和感染等并發癥的發生的風險。β微球蛋白(β2M)是由100個氨基酸殘基組成，是構成細胞膜上組織相容性抗原的一部分〔3〕。相關研究表明炎癥、風濕性疾病、腫瘤和肝臟類疾病可能促使β2M合成增加〔4〕。花生四烯酸(AA)是人體分布比較廣泛的脂肪酸，生物活性較強，是人體炎癥和氧化應激活性物質代謝的主要組成部分。相關研究顯示，AA與早期胰島素抵抗的發生和發展關系密切〔5〕。白三烯(LT)B4與血栓素(TX)A2是較為常見的AA代謝物，目前關于β2M和AA代謝物在腎功能衰竭炎癥反應中的相關報道較少，所以本研究深入探討β2M、LTB4與TXA2對老年大鼠慢性腎臟疾病炎癥反應。

1 材料和方法

1.1實驗動物 清潔級健康的老齡SD大鼠20只，月齡18 w，體重500～650 g，SPF 級，購自南京君科生物工程有限公司〔SCXK(蘇)2019-0001〕，飼養在海南省實驗動物中心〔SCXK(瓊)2019-0007〕，在消過毒的獨立通風系統籠具(IVC)籠內中飼養，光照和黑暗交替12 h，溫度40%～55%，濕度21～25℃,每個籠中5只，動物實驗方案經過海南醫學院動物管理使用委員會批準(IACUC-2019-013-09)，在飼養和實驗的過程中嚴格貫徹3R原則。采用隨機數字表法分為4組，每組5只，分別為對照組〔注射1 mg/kg脂多糖(LPS)〕、β2M抑制劑組〔注射1 mg/kg LPS+二肽基肽酶(DPP)-4抑制劑5 mg/kg〕、AA抑制劑組(注射1 mg/kg LPS + HET0016 20 mg/kg)和β2M+AA抑制劑組(注射1 mg/kg LPS+DPP-4抑制劑 5 mg/kg + HET0016 20 mg/kg)。

1.2主要試劑和儀器 β2M抑制劑購自北京百奧博科技有限公司；CYP4A 抑制劑(HET0016)購自上海工碩生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自上海語純生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物(GSH-PX)酶檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒、活性氧(ROS)初級熒光測定試劑盒檢測購自南京建成生物工程研究所；髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；鼠抗β2M抗體 、鼠抗LTB4抗體、鼠抗TXA2抗體、兔抗單核細胞趨化蛋白(MCP)-1抗體、兔抗P-P65抗體、磷酸化核因子κB抑制蛋白(P-IKB)α抗體、鼠抗P65抗體和鼠抗磷酸化IκB激酶(P-IKK)β抗體購自美國 Promega 公司；鼠抗白細胞介素(IL)-1β抗體、鼠抗IL-6抗體和鼠抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Coming Costar公司；蛋白電泳儀美國ABI公司。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型建立 大鼠腹腔注射LPS，按照體重每天1 mg/kg，連續注射8 w，在第一次注射LPS前2 d，通過腹腔給藥DPP-4抑制劑和HET0016，β2M抑制劑組大鼠注射DPP-4抑制劑，按照體重每天5 mg/kg，AA抑制劑組大鼠注射HET0016，按照體重每天20 mg/kg，β2M+AA抑制劑組大鼠注射DPP-4抑制劑5 mg/kg 和HET0016 20 mg/kg，直到第8周處死大鼠，在第8周收集腎皮質組織，進行下一步分析。

1.3.2Western印跡檢測β2M 、LTB4、TXA2、MCP-1、P-P65和P-IKBα、P65和P-IKKβ蛋白 取大鼠腎組織，加入蛋白裂解液制成勻漿，然后進行離心處理，提取組織中總蛋白測定濃度,在100 V對總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白樣品采用Bradford法定量,將電泳產物轉至PVDF 膜上，用10%的山羊血清，封閉0.5 h，分別加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗孵育2 h，GAPDH作內參，用 Image J 分析軟件檢測條帶灰度值，檢測β2M LTB4 與TXA2、MCP-1、P-P65和P-IKBα、P65和P-IKKβ蛋白表達。

1.3.3PAS染色觀察大鼠腎組織病理學變化 取大鼠腎組織，切片、脫蠟，在使用1%高碘酸鈉水溶液氧化20 min，PBS沖洗3次后，在使用Shiff 液染色30 min，染色后，經過蒸餾水分化5 min，蘇木素染色20 s，以濃度為1%的鹽酸乙醇分化10 s，PBS沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，采用中性樹膠進行封固，鏡下觀察。

1.3.4免疫氧化相關指標SOD、CAT、GSH-PX、ROS、MPO和MDA檢測 將大鼠腎組織制備成10%的組織勻漿，采用SOD檢測試劑盒檢測SOD活性，采用GSH-PX酶檢測試劑盒檢測GSH-PX活性，采用CAT檢測試劑盒檢測CAT和MDA活性，采用初級熒光測定試劑盒檢測ROS活性,使用MPO檢測試劑盒檢測MPO含量，所有操作均按照試劑盒的使用說明進行嚴格操作。

1.3.5免疫組織化學方法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平 將腎組織脫蠟，進行烤片處理，將熱玻片放入二甲苯中處理2次，每次10 min，無水乙醇2次，每次5 min，H2O2阻斷20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，將玻片置于0.01 mol/L枸椽酸中修復液,微波修復2次,冷卻后，PBS沖洗3次，將非免疫血清滴加于玻片上置37℃恒溫箱孵育30 min,抹干切片后,滴加特異性抗體，恒溫箱孵育20 min,過夜，滴加標記的二抗,恒溫箱孵育，再將二氨基聯苯胺(DAB)液體滴加到切片上，直到染色滿意后為止，染色后用自來水沖洗，蘇木素復染,脫水烘干后用中性樹膠封片,光鏡下觀察切片染色情況并攝影。觀察IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達情況。

1.4統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2 結 果

2.1大鼠腎組織中β2M和AA代謝物水平對比 模型組β2M 、LTB4與TXA2蛋白水平明顯高于對照組(均P<0.05)，見圖1、表1。

2.2β2M和AA代謝物抑制劑對大鼠腎臟病理形態學的影響 PAS染色發現，對照組明顯的腎小球硬化，而經過β2M和AA抑制劑處理過的β2M抑制劑組和AA抑制劑組腎小球硬化改善明顯，經過β2M和AA抑制劑共同處理后β2M+AA抑制劑組腎小球硬化改善更為顯著，見圖2。

2.3β2M和AA代謝物抑制劑對大鼠腎臟免受氧化損傷影響 與對照組相比，β2M抑制劑組和AA抑制劑組SOD、CAT和GSH-PX蛋白水平顯著升高(P<0.05)，與β2M抑制劑組和AA抑制劑組相比，β2M+AA抑制劑組SOD、CAT和GSH-PX蛋白水平升高更為明顯(P<0.05)；與對照組相比，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中的ROS、MPO和MDA蛋白水平顯著降低(P<0.05)，與β2M抑制劑組和AA抑制劑組相比，β2M+AA抑制劑組中的ROS、MPO和MDA蛋白水平降低更為明顯(P<0.05)，見表2。

圖1 Western印跡檢測各組β2M 、LTB4與 TXA2蛋白表達

表1 各組腎組織中β2M、LTB4和TXA2的表達

圖2 各組腎臟病理形態學情況(PAS染色，×200)

表2 各組腎臟免受氧化損傷各指標水平表達

2.4β2M和AA代謝物抑制劑對大鼠腎臟炎癥的影響 與對照組相比，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平顯著降低(P<0.05)，與β2M抑制劑組和AA抑制劑組相比，β2M+AA抑制劑組中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平降低更為明顯(P<0.05)，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平對比無顯著性差異(P>0.05)，見表3、圖3。

表3 各組腎臟炎癥情況對比

圖3 各腎臟炎癥情況(免疫組化學染色，×200)

2.5β2M和AA代謝物抑制劑對大鼠腎臟相關蛋白表達 β2M抑制劑組和AA抑制劑組中MCP-1、P-P65和P-IKBα蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)，β2M+AA抑制劑組中MCP-1、P-P65和P-IKBα蛋白水平明顯低于β2M抑制劑組和AA抑制劑組(P<0.05)，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中MCP-1、P-P65和P-IKBα蛋白水平對比無顯著差異(P>0.05)；4組P65蛋白水平無顯著差異(P>0.05)；β2M抑制劑組和AA抑制劑組P-IKKβ蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)，β2M+AA抑制劑組中P-IKKβ蛋白水平明顯高于β2M抑制劑組和AA抑制劑組(P<0.05)，見圖4、表4。

1～4：對照組,β2M抑制劑組,AA抑制劑組,β2M+AA抑制劑組圖4 各組腎臟組織的相關蛋白表達

表4 各組腎臟組織相關蛋白表達

3 討 論

據估計全世界慢性腎臟疾病的患病率為8%～16%〔6〕。目前，沒有單一的治療方法來改善慢性腎臟疾病患者的腎功能，腎功能的持續惡化會發展為腎衰竭〔7〕，因此，找到有效的治療方法仍然是當務之急。炎癥反應和氧化應激是慢性腎臟疾病發生和發展的共同特征和主要介質，炎癥細胞的浸潤及炎癥介質的釋放是腎臟損傷的發生和發展的始動因素〔8〕，氧化應激的持續性會伴有炎癥反應的發生，因此控制相關發生因素可能是治療慢性腎臟疾病的藥物靶點。

β2M是人體核細胞產生的一種大分子蛋白，當β2M在體內產生量恒定時，易于腎小球濾過〔9〕。LTB4與TXA2是慢性腎臟疾病患者體內中間代謝產物，LTB4與TXA2水平的變化極容易導致腎臟局部缺血發生紊亂〔10〕，相關研究報道，LTB4與TXA2在血管平滑肌中促進細胞凋亡〔11〕。本研究結果提示慢性腎臟疾病的大鼠中β2M、LTB4與TXA2蛋白水平明顯高于正常大鼠的水平，所以說β2M、LTB4與TXA2可能是衡量慢性腎臟疾病比較重要的指標。相關研究表明，當體內β2M水平顯著升高時，證明腎功能對該物質的代謝量降低〔12〕。所以說明β2M、LTB4與TXA2分泌過多對腎臟產生不利的影響。

氧化應激反應是導致腎損傷的關鍵環節，慢性腎臟疾病中ROS的增加會伴隨著腎臟內源性抗氧化防御系統的損傷〔13〕。以前的藥理學研究集中在防止ROS的產生，或者增加細胞的抗氧化劑〔14〕，然而，這些方法受到各種復雜因素的限制，還有待于進一步的研究。腎組織產生過多的ROS會導致內皮損傷，增殖組織水腫和血管的滲透性〔15〕。酶和非酶系統是ROS的內源性防御機制，ROS產生過量和抗氧化能力的降低引起腎損傷的惡化〔16〕。SOD和CAT是腎臟中的中性粒細胞活化通過炎性因子以及ROS釋放，能夠促進腎損傷和遠隔器官的損傷〔17〕。SOD催化超氧化物自由基，保護細胞不受ROS侵害。GSH-PX是一個硒蛋白家族，負責將其他有機過氧化物轉化為水和氧〔18〕。CAT是一種常見的抗氧化酶，大量存在于肝臟、肺和腎臟中，CAT通過降解過氧化氫，在保護生物免受ROS氧化損傷方面發揮重要作用〔19〕。本研究結果說明有效抑制β2M、LTB4與TXA2水平，能夠降低氧化應激的產生和相關因子的釋放，從而緩解氧化應激對腎損傷的影響。

過度的氧化應激會導致炎癥反應的發生，炎癥反應也是腎損傷的重要生理過程〔20〕。MCP-1是一種趨化因子，趨化和激活巨噬細胞趨化和激活，促進IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥物質大量分泌，損傷局部和遠程組織〔21〕。考慮到通過DPP-4和HET0016可以顯著下調ROS水平，就能夠減少IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥物質大量的釋放，它有效地中和活性氧并幫助排毒有毒化學物質，抑制NF-κB核易位的磷酸化，調節MCP-1、P-P65、P-IKKβ和P-IKBα水平，阻礙炎性細胞因子的產生。

綜上，β2M、LTB4和TXA2有可能成為慢性腎炎的生物標志物，抑制β2M、LTB4和TXA2，有助于增加抗氧化物的含量，來減少氧化應激反應，降低炎癥反應，從根本上防止慢性腎臟疾病的進一步損傷，同時為臨床上防治慢性腎臟疾病的進一步發展提供新的藥物作用靶點。