TPARM對人結直腸癌細胞株SW480增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響

陳科全 葉展暉 許研 董旻昱

(廣州醫科大學 1附屬第一醫院消化內科，廣東 廣州 510000；2附屬第二醫院消化內科；3廣州市干部健康管理中心消化科)

結直腸癌是世界上常見的惡性腫瘤，由于早期結直腸癌臨床表現無特異性癥狀及體征，當出現癥狀再進行檢查時很多患者病程已處于晚期，而晚期結直腸癌患者5年生存率不足10%〔1～3〕。因此，在基因水平發現及深入研究與結直腸癌發生發展的相關基因，對結直腸癌的早期防治和晚期診治都具有重要的意義。

四三肽重復序列(TPR)蛋白最早是酵母的細胞分裂周期蛋白中的一個蛋白相互作用的組件〔4〕，含TPR模體的蛋白質在許多生理過程中起作用，其中包括細胞周期、細胞應激、線粒體及微體膜的蛋白質轉運、轉錄和腫瘤發生等〔4～6〕。四三肽重復結構域(TTC)12，也被稱為TPARM，是利用生物信息學方法篩選出的一個新的人類基因，位于NCAM1和DRD2基因之間，定位于人染色體11q23.2。TPARM是一種含有TPR 模體的蛋白質，有研究報道TPARM 的mRNA在結腸癌、胃癌、成神經細胞瘤、畸胎瘤中表達增加，而且TPR蛋白結構域的突變可能參與了這些腫瘤的發生發展〔7〕。在急性淋巴白血病研究中發現TPARM基因啟動子特異性高甲基化導致其表達減少，因此推測TPARM可能參與急性淋巴細胞白血病的發生〔8〕。此外， Thomas等〔9〕的研究發現TPARM基因突變會導致其功能受到影響，可能會導致運動纖毛功能障礙導致黏液纖毛清除功能受損和早期反復呼吸道感染，也會增加原發性纖毛運動障礙疾病發生風險，而TPARM可能參與動力蛋白的組裝，因此，TPARM可能也影響腫瘤細胞的侵襲和轉移。本研究檢測結直腸癌細胞株SW480內TPARM表達的情況及其對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，探討TPARM在結直腸癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 RPMI1640細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國的Gibco公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、逆轉錄試劑盒購自中國天根生化科技公司；細胞計數試劑盒(CCK)8購自美國 Bimake公司,二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒購自中國碧云天生物研究所；預染蛋白marker、電化學發光(ECL)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；TPARM抗體、山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司，髓細胞白血病序列(Mcl)-1、B淋巴細胞瘤(Bcl)-xl、Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、周期蛋白依賴性激酶(CDK)2、CDK4、CDK6抗體購自美國CST公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自于中國凱基生物科技發展有限公司；Transwell小室和基質膠購于美國Corning公司。

1.1.2主要儀器 細胞超凈臺、恒溫細胞培養箱、RT-PCR儀為美國Thermo Fisher Scientific公司產品；多功能酶標儀為美國Biotek公司產品；流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品；蛋白電泳儀為美國Bio-Rad公司產品；定量PCR儀為瑞士Roche公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組處理 人結腸癌細胞株SW480購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，將細胞復蘇后培養于體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，并置于37℃、體積分數為5% CO2的培養箱中培養。當細胞生長至70%以上后消化傳代以進行后續實驗。取對數生長期的SW480細胞分組轉染，按照Lipofectamine2000試劑盒說明書步驟操作。實驗分為3組，NC組：SW480細胞不做任何處理；TPARM-siRNA組：SW480細胞轉染TPARM-siRNA(TPARM-siRNA序列，正義鏈：5′-GCUGAAGGCAAUUAUGAAATT-3′，反義鏈：5′-UUUCAUAAUUGCCUUCAGCTT-3′)；Scr-siRNA組：SW480細胞轉染Scr-siRNA。轉染后在37℃、體積分數為5% CO2常規培養48 h，再收集各組細胞進行實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測TPARM mRNA的表達 取對數生長期的上述3組SW480細胞，用Trizol試劑分別進行消化裂解獲取總的RNA，RNA反轉錄合成cDNA,然后進行RT-qPCR。根據試劑盒說明書配制反應體系，分別比較上述3組細胞的TPARM的mRNA表達量。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參對照計算TPRAM mRNA表達水平(GAPDH和TPARM的序列為：GAPDH正義鏈：5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3′，反義鏈：5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′；TPARM正義鏈：5′-AGTATCATCAGTGACAACGAGG-3′，反義鏈：5′-GAACAGACACACAGACCATTTC-3′)。實驗重復3次，取其均值。

1.2.3Western印跡法檢測TPARM、Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2、Bax、CDK2、CDK4、CDK6蛋白的表達 取對數生長期的上述3組SW480細胞，用放射免疫沉淀法RIPA裂解液冰上裂解細胞提取總蛋白，在質量分數為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下封閉1 h，4℃敷一抗過夜，Tris鹽緩沖液吐溫洗滌3次，每次10 min,室溫敷二抗2 h，洗滌后用ECL檢測試劑顯影條帶，使用ImageJ軟件對條帶進行定量。

1.2.4CCK8法檢測各組SW480細胞增殖情況 取對數生長期的上述3組SW480細胞，離心5 min(1 000 r/min)，制備成單細胞懸液，將細胞以5 000個/孔鋪于96孔培養板中，每組設置5個平行孔，放置在37℃，體積分數為5% CO2培養箱中，分別于培養 0、24、48、72 h后分別取出，向各待測孔中加入10 μl CCK8溶液，再繼續培養2 h后，在酶聯免疫檢測儀進行450 nm處吸光度值測定，實驗重復3次。

1.2.5平板克隆形成實驗觀察各組SW480細胞增殖情況 取對數生長期的上述3組SW480細胞，離心5 min(1 000 r/min)，制備成單細胞懸液，將細胞接種于12孔培養板中，輕搖混勻，在37℃、體積分數為5% CO2常規培養14 d使細胞形成集落,將各孔培養基棄去，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min后，棄去固定液，加入結晶紫染色20 min。在光學顯微鏡下觀察細胞增殖形成的集落，計算克隆形成率=(各組克隆數/各組細胞數)×100%。重復上述實驗步驟3次。

1.2.6流式細胞術(FCM)檢測各組SW480細胞凋亡情況 取適量對數生長期的上述3組SW480細胞，接種細胞至6孔細胞培養板，24 h后，收集1×105～5×105個細胞，加入500 μl的膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素、懸浮細胞，每組細胞加入5 μl的膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素和5 μl的碘化丙啶(PI)染色液，室溫、避光、反應5～15 min后，在1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測，并經FlowJo軟件分析結果。

1.2.7Transwell小室侵襲實驗檢測各組SW480細胞侵襲能力 將Transwell小室內鋪上1∶10稀釋的基質膠。取適量對數生長期的上述3組SW480細胞，消化、離心后用不含用FBS的培養基制備成單細胞懸液，將200 μl密度為5×105個/ml的細胞鋪于小室中，650 μl含20% FBS的培養基加入下室，置于37℃培養箱48 h后取上室，使用4%多聚甲醛固定15 min，用棉簽將小室上未穿過聚碳酸酯膜輕柔擦拭，用PBS清洗3次，室溫下 0.1%結晶紫染色30 min后用PBS清洗干凈，用棉簽擦拭小室殘留的結晶紫和PBS后晾干，后于倒置顯微鏡下隨機觀察3個視野中細胞數。重復上述實驗步驟3次。

1.2.8劃痕實驗檢測各組SW480細胞遷移能力 取適量對數生長期的上述3組SW480細胞，消化、離心后制備成單細胞懸液，將SW480細胞接種到6孔板上，細胞貼壁后用200 μl槍頭垂直于孔背面標記線的垂線做劃痕，用PBS清洗3次后加入無血清培養基置于37℃培養箱中培養，分別取劃痕后0、48 h培養板于顯微鏡下觀察劃痕彌合情況并拍照。重復上述實驗步驟3次。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1TPARM-siRNA對SW480細胞中TPARM的mRNA和蛋白表達水平的影響 NC組和Scr-siRNA組TPARM mRNA和蛋白的表達水平無顯著性差異(P>0.05)；而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較，TPARM mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測下調TPARM后 SW480細胞中TPARM的蛋白水平

表1 TPARM-siRNA轉染后對SW480細胞中TPARM的 mRNA和蛋白表達水平的影響

2.2下調TPARM對SW480細胞增殖水平的影響 NC組和Scr-siRNA組細胞增殖無顯著性差異(P>0.05),而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較，相對細胞活力和克隆形成率明顯降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 TPARM-siRNA轉染后對SW480細胞中增殖水平的影響

圖2 平板克隆法檢測下調TPARM后SW480細胞增殖水平的變化(結晶紫染色)

2.3下調TPARM對SW480細胞周期相關蛋白表達水平的影響 NC組、Scr-siRNA組CDK2、CDK4及CDK6蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較，CDK2、CDK4及CDK6蛋白的表達水平明顯下降(P<0.05)，見表2、圖3，提示敲低TPARM能影響結腸癌SW480細胞的G1/S期，從而抑制結腸癌SW480的增殖作用。

2.4下調TPARM對SW480細胞凋亡的影響 NC組和Scr-siRNA組細胞凋亡無顯著性差異(P>0.05)；而分別與NC組和Scr-siRNA組比較，TPARM-SiRNA組SW480細胞凋亡率均增加(P<0.05)，見圖4、表3。

2.5下調TPARM對SW480細胞凋亡相關蛋白表達的影響 NC組、Scr-siRNA組的Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2及Bax蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組分別與NC組和Scr-siRNA組比較， Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1蛋白的表達水平明顯下降，Bax蛋白的表達量明顯增加(P<0.05)，見表3、圖5。

圖3 Western印跡法檢測下調TPARM后SW480細胞中 周期蛋白CDK2、CDK4、CDK6的水平

圖4 流式細胞術檢測下調TPARM后對SW480細胞凋亡率的影響

表3 TPARM-siRNA轉染后對SW480細胞凋亡水平的影響

圖5 Western印跡檢測轉染TPARM-siRNA后 SW480細胞凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2、Bax表達

2.6下調TPARM對SW480細胞侵襲、遷移能力的影響 NC組、Scr-siRNA組SW480細胞的侵襲能力無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組SW480細胞分別與NC組和Scr-siRNA組SW480細胞比較，侵襲能力明顯下降(P<0.05)。NC組、Scr-siRNA組SW480細胞的遷移能無顯著性差異(P>0.05)，而TPARM-siRNA組SW480細胞分別與NC組和Scr-siRNA組SW480細胞比較，遷移能力明顯下降(P<0.05)。見圖6、圖7、表4。

圖6 Transwell小室侵襲實驗檢測下調TPARM后SW480細胞侵襲能力的變化(結晶紫染色，×100)

圖7 劃痕實驗檢測下調TPARM后SW480細胞遷移能力的變化(×40)

表4 TPARM-siRNA轉染后對SW480細胞侵襲、 遷移的影響

3 討 論

結直腸癌為消化道常見惡性腫瘤之一，而晚期結直腸癌患者5年生存率較低〔10〕。對結直腸癌的研究仍然存在很多未知領域〔11～14〕，因此結直腸癌發生的相關基因及分子機制的研究有助于進一步發現潛在的診斷和治療結直腸癌的新靶點。TPARM是一種能編碼蛋白質的基因，其結構包括TPR結構域和ARM結構域，結構域的突變能促進腫瘤的發生。本研究利用TPARM-siRNA轉染SW480，初步結果顯示TPARM mRNA和蛋白表達明顯受到抑制,驗證了TPARM-siRNA的轉染效率。在后續實驗中敲低TPARM后，通過CCK8、平板克隆實驗、流式細胞術檢測、Western印跡法檢測、Transwell小室侵襲實驗及劃痕實驗初步了解TPARM在結直腸癌細胞中的生物學行為，推測其可能通過促進結腸癌細胞的增殖和抑制其凋亡，同時促進其侵襲、遷移能力。因此由初步實驗結果判斷，TPARM可能在結直腸癌發生發展過程中發揮重要的作用，可能是潛在的癌基因。

細胞周期依賴性激酶(CDKs)是真核生物細胞周期有序驅動的核心調控子，參與細胞周期調控的CDKs中CDK2、CDK4和CDK6主要作用于細胞周期的G1期和S期,參與DNA復制的啟動和誘發有絲分裂。CDK2蛋白已被證實在結腸癌組織中較正常組織明顯升高,有研究發現，CDK2是結腸癌細胞中姜黃素的直接靶標，姜黃素能通過抑制CDK2活性阻滯結腸癌細胞的增殖〔15〕。本研究發現，敲低TPARM后CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達水平明顯下降，考慮TPARM可能通過影響結腸癌細胞周期中的G1期和S期來影響結腸癌細胞的增殖水平。

Bcl-2家族是與細胞凋亡密切相關的一個家族，美國藥物管理局現已批準以Bcl-2為設計靶點的藥物用于癌癥治療〔16〕。Bcl-2家族中抗凋亡的蛋白包括有Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1等，它們通過抑制促凋亡蛋白發揮抗細胞凋亡的作用；與之作用相反的促凋亡的蛋白有Bcl-2拮抗/殺傷因子(Bak)、Bax、Bcl-2家族凋亡調節劑(Bok)等，通過在線粒體膜上形成線粒體膜通道釋放細胞色素C,激活下游半胱氨酸蛋白酶(caspases)來發揮促進細胞凋亡的作用。Bcl-2常作為腫瘤藥物靶標,有研究發現，抑制Bcl-2的表達可以明顯抑制肺癌細胞的細胞遷移和集落形成,體內及體外實驗都明顯降低了肺癌細胞的生長〔17〕,也有研究證實在治療急性髓細胞白血病中，抑制Mcl-1為靶向的藥物具有很大的治療價值〔18〕。本實驗結果表明，敲低TPARM后Mcl-1、Bcl-xl、Bcl-2的蛋白表達水平下降，Bax表達升高，考慮TPARM抑制結腸癌細胞的凋亡與其影響Bcl-2家族部分蛋白的表達相關。

綜上，TPARM在結直腸癌中可能具有重要作用，與結腸癌細胞增殖增加及凋亡減少相關，為TPARM在結直腸癌中發揮重要作用提供實驗依據；結合臨床研究TPARM的功能、基因調控機制及其與結直腸癌患者病情及預后之間的關系，探尋新的結直腸癌診斷標志點及治療新靶點。