黃連解毒湯通過抑制ApoE-/-小鼠巨噬細胞極化和炎癥減輕高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化

何金濤 軒弘源 羅舒文 吳瓊 俞琦 田維毅

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

近年來，中國心血管疾病(CVD)患病率和死亡率呈現逐年上升的趨勢〔1〕。動脈粥樣硬化(AS)被認為是一種慢性炎癥性疾病，是引發CVD常見的病理基礎〔2〕。巨噬細胞(Macrophage)可通過吞噬(胞吞)、增殖、遷移和分泌促炎因子等方式參與AS發生、發展及最后斑塊破裂的整個過程，并起著關鍵作用〔3，4〕。研究表明，調控巨噬細胞極化方向，可能是干預AS的一種有效途徑〔5〕。中藥在AS治療中具有巨大的潛質，運用中藥抑制巨噬細胞向M1型極化、促進向M2型極化，表現出了較強的抗炎性并能增加AS斑塊的穩定性〔6〕。黃連解毒湯(HLJDD)為經典的中藥復方，記載于《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子四位中藥組成，具有清三焦火熱，解毒的功效。現代藥理學研究發現其具有抗炎、降脂的作用，并能抑制AS進展〔7〕。本研究通過觀察HLJDD對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠AS模型主動脈病理、血清炎癥因子及巨噬細胞極化標記物CD197、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和CD206表達的影響，探討其通過抑制巨噬細胞極化和炎癥發揮抗AS作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與藥材 8周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠，體重18～22 g，購于北京大學醫學部實驗動物中心，許可證號：SCXK(京)〔2016-0010〕。中藥飲片黃連、黃芩、黃柏、梔子一次性購于北京同仁堂貴陽分店，經貴州中醫藥大學生藥教研室專家鑒定為正品。

1.1.2主要試劑與儀器 總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒購自中生北控生物科技有限公司；超敏C反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-4和IL-10酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、iNOS抗體、CD197山羊多克隆抗體、CD206兔多克隆抗體、驢抗山羊免疫球蛋白(Ig)G二抗和山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司；蘇木素染液、油紅O染液購自美國Sigma公司；FC型酶標儀、-80℃超低溫冰箱、高速冷凍離心機購自Thermo公司；AU480型全自動生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1制備HLJDD水煎液 黃連解毒湯按原方配伍比例3∶2∶2∶3(即黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子 9 g )進行常規方法配制。調至濃度為2 g/ml，放置于4℃冰箱備用，每周制備一次。

1.2.2動物 AS模型建立〔8〕ApoE-/-小鼠24只，適應性喂養1 w后開始給予含脂肪37%、蛋白質19.7%、碳水化合物43.3%的滅菌(西方膳食型)高脂飼料飲食造模。另設同周齡野生型C57BL/6J小鼠6只為正常(Control)組，給予普通飼料。造模12 w，確定AS成模后，將AS模型小鼠隨機分為模型(Model)組、黃連解毒湯高劑量(HLJDD-H)組、黃連解毒湯低劑量(HLJDD-L)組，每組6只，HLJDD-H、HLJDD-L給藥劑量分別為10 g/(kg·d)、2.5 g/(kg·d)，給藥體積為0.1 ml/10 g，正常組和模型組給予同體積生理鹽水，灌胃6 w，每日1次。

1.2.3血清及主動脈標本采集 給藥結束后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，常溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清后-20℃冰箱保存，用于生化指標檢測。無菌條件下取心臟及主動脈，一部分存放于10%中性甲醛溶液固定，另一部分液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。取材過程符合實驗動物倫理學要求。

1.2.4血脂檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

1.2.5主動脈蘇木素-伊紅(HE)染色 從10%中性甲醛中取出心臟及主動脈根部石蠟包埋，進行常規HE染色，光學顯微鏡下觀察主動脈病理變化并拍照保存。

1.2.6主動脈油紅O染色 將主動脈根部進行橫切制作冰凍切片，進行常規油紅O染色，拍照并用Image Pro Plus軟件對斑塊面積進行分析。

1.2.7免疫熒光染色 將主動脈放入多聚甲醛20 min，室溫下通透組織切片20 min，3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，按1∶100滴加iNOS和CD206抗體，4℃過夜，按1∶2 000滴加二抗，室溫1 h，按1∶7 000滴加4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，染色15 min。封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄并用Image pro plus軟件進行分析。

1.2.8免疫組化染色(IH) 將主動脈依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，梯度酒精各3 min，蒸餾水浸洗2 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，修復抗原。3%過氧化氫溶液避光孵育20 min。加一抗孵育15 h，加二抗孵育50 min。加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，陽性信號顯示為棕色，蘇木素復染3 min，氨水返藍。依次放入梯度酒精、無水乙醇、二甲苯進行脫水。封片，光學顯微鏡下觀察、拍照并用Image Pro Plus軟件進行指標分析。

1.2.9血清指標檢測 采用ELISA檢測各組小鼠血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-10含量，嚴格依照試劑盒說明書進行操作。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1HLJDD對各組血脂水平的影響 與Control組比較，Model組TC、TG和LDL-C水平均顯著升高，HDL-C顯著降低(P<0.01)。與Model組相比，HLJDD-H和HLJDD-L組TC、TG、和LDL-C水平均明顯降低，HDL-C顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中TC、TG、LDL-C、HDL-Chs-CRP、TNF-α及IL-6水平比較

2.2HLJDD對各組血清中炎癥因子水平的影響 與Control組比較，Model組hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均明顯升高，IL-4、IL-10水平明顯降低(P<0.01)。與Model組相比較，HLJDD-H和HLJDD-L組hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10水平均明顯升高(P<0.05)。見表1、表2。

2.3HE染色觀察主動脈病理形態 與Control組比較，Model組主動脈內膜大面積增厚，形成明顯的泡沫細胞，部分區域出現特征性的AS斑塊。與Model組比較，HLJDD-H和HLJDD-L組主動脈斑塊及血管壁泡沫細胞明顯減少。其中，HLJDD-H組比HLJDD-L組顯效更為明顯。見圖1。

表2 各組血清中IL-4、IL-10水平比較

圖1 HE染色觀察各組主動脈病理變化(×40)

2.4油紅O染色觀察AS斑塊 與Control組比較，Model組主動脈存在大面積斑塊，且分布大量脂滴。與Model組比較，HLJDD-H和HLJDD-L組主動脈斑塊面積和脂滴都明顯減少，HLJDD-H組比HLJDD-L組減少更為明顯。見圖2。

2.5免疫熒光染色觀察HLJDD對主動脈巨噬細胞iNOS、CD206表達的影響 與Control組比較，Model組M1型極化標志物iNOS表達量明顯升高，M2型極化標志物CD206表達量顯著降低(P<0.01)。與Model組比較，HLJDD-H和HLJDD-L組iNOS表達明顯降低，CD206表達顯著升高(P<0.01)。HLJDD-H組影響更明顯。見表3、圖3、圖4。

圖2 油紅O染色觀察各組AS斑塊(×40)

表3 各組主動脈壁iNOS、CD206水平、主動脈CD197、CD206陽性表達率比較

圖3 免疫熒光觀察各組主動脈斑塊iNOS表達量的變化(×200)

2.6免疫組化觀察主動脈CD197、CD206分子表達 陽性細胞顯色為棕色，藍色為細胞核。與Model組相比，HLJDD-H和HLJDD-L組CD197明顯減少，CD206明顯增多(P<0.01，P<0.05)。見表3、圖5、圖6。

圖4 免疫熒光觀察各組主動脈斑塊CD206表達量的變化(×200)

圖5 免疫組化觀察各組主動脈CD197 變化(×400)

圖6 免疫組化觀察各組主動脈CD206 變化(×400)

3 討 論

AS屬于一種動脈壁慢性炎癥性疾病〔9〕，炎癥反應在AS中扮演著重要角色。AS形成過程主要以脂質和炎癥細胞積累導致壞死性巨噬細胞和泡沫細胞積聚為特征〔10〕，活化的巨噬細胞通過炎癥機制在AS中發揮重要作用〔11〕。巨噬細胞廣泛參與免疫系統調節，具有較強的可塑性，根據極化后功能表現被分為M1型和M2型。經典的M1型巨噬細胞具有促炎作用，極化的M2型巨噬細胞具有抗炎作用〔12〕。大量聚集的內源性脂質被氧化成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，可誘導趨炎性因子，如γ-干擾素(IFN-γ)、TNF-α、CRP等，激活單核細胞或巨噬細胞向經典的M1型巨噬細胞極化，并分泌活性氧(ROS)、iNOS和IL-6等發揮促炎活性。IL-4則激活巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化，并分泌抗炎因子IL-10發揮抗炎活性，能夠起到組織修復和穩定AS斑塊作用〔10〕。因此，如何抑制巨噬細胞向M1型極化，促使向M2型分化將是控制炎癥和AS發展的關鍵。

近年來，中草藥在AS的治療中表現出了多效應、多靶點和多途徑的優勢。中醫認為AS的病機多為“熱邪”與“毒邪”蘊積。HLJDD作為清熱解毒類代表方劑，具有清瀉三焦之火，清熱解毒的功效，方中黃連、黃芩、黃柏、梔子按君、臣、佐、使合理配伍，使清解上中下三焦火熱毒邪之力更強。現代藥理學研究發現，組方中的有效成分黃芩苷、小檗堿、梔子苷等具有抗炎、抗氧化、調脂、保護內皮細胞、穩定斑塊的作用〔7，13〕。同時，實驗研究也發現，HLJDD確有調控炎癥反應，干預AS的作用〔14〕。目前，HLJDD在臨床炎癥性疾病中得到較多應用并顯示出了良好的治療效果。

本研究結果證實，HLJDD確有抗AS作用。iNOS在M1型巨噬細胞中出現高表達，能夠損傷內皮細胞，促使炎癥進一步發展及AS斑塊的形成〔15〕，CD206作為M2型巨噬細胞極化的重要標志，其水平升高提示巨噬細胞產生了抑炎作用來調節AS炎癥發展。因此，本研究推測，HLJDD抗AS作用可能與其促進巨噬細胞向M2型極化，抑制M1型極化有關。與課題組前期研究一致〔16，17〕，本研究結果也顯示，HLJDD發揮抗炎、抗AS作用存在一定的量效關系。本研究將為清熱解毒類方藥應用于抗AS及相關炎癥性疾病積累科學依據。