基于線粒體凋亡通路探究右美托咪定對心肌缺血再灌注模型大鼠的干預效果

王麗 王少微 賈彤 孫曉佳 邢珍 劉輝 姚杰 陳艷林

(河北北方學院附屬第一醫院麻醉科，河北 張家口 075000)

心肌缺血是一種病理生理狀態，是由于心臟的血液灌注量減少，從而導致心臟供氧不足，心肌能量代謝異常的現象〔1,2〕。有研究表示，冠心病、變異性心絞痛、心肌橋等是主要病因〔3〕。據流行病學調查顯示，中老年人為易發人群，男性發病人數高于女性，發達國家發病率較高，近年來該病發病率呈年輕化趨勢，嚴重威脅著患者的健康〔4,5〕。右美托咪定是一種注射劑，具有鎮定安神的作用〔6〕。本研究建立心肌缺血再灌注大鼠模型，分析右美托咪定對心肌缺血再灌注模型大鼠線粒體凋亡通路的影響，旨在探討右美托咪定是否經線粒體凋亡通路參與該病的發生發展。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SPF級雄性大鼠(山東軒竹醫藥科技有限公司，使用許可證號：SYXK(魯)20200001)，2～4月齡，平均(3.1±0.8)月齡；體重265～312 g，平均體重(288.5±18.8)g。在相對濕度40%～65%、溫度(24.1±2.6)℃的環境中適應性喂養1 w。本試驗嚴格按照動物實驗倫理要求進行操作，且通過醫院倫理委員會審批同意。主要試劑：小鼠抗大鼠白細胞介素(IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)抗體(BD公司)、小鼠抗兔C反應蛋白(CRP)抗體(Dako公司)、兔抗小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Gibco公司)、大鼠抗兔丙二醛(MDA)抗體(上海國藥集團化學試劑有限公司)、大鼠抗小鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)抗體(Sigma公司)、兔抗大鼠細胞色素(Cyto)C、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(Hyclone公司)。主要儀器：多道生理記錄儀(河南華南醫電科技有限公司)、光學顯微鏡(上海炳宇光學儀器有限公司)、流式細胞儀(天津眾立生物科技有限公司)、小動物呼吸機(天津儀數科技有限公司)、彩色多普勒超聲診斷儀(徐州貝爾斯電子科技有限公司)、PE50動脈導管(上海瑾瑜科學儀器有限公司)。

1.2分組及建模 隨機選取10只大鼠作為正常組，剩余30只大鼠參照羅敏等〔7〕研究建立心肌缺血再灌注模型，30只雄性大鼠分別禁食12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位進行固定，小動物呼吸機機械通氣，四肢皮下插入電極，連接心電圖。在大鼠胸骨左緣第4肋間逐層打開胸腔，充分暴露心臟和血管，結扎左冠狀動脈前降支，誘發心肌缺血30 min，然后松開結扎線再灌注60 min。心肌缺血再灌注造模成功的標志，心電圖ST段明顯抬高、T波高聳。建模過程中大鼠死亡2只，將剩余的28只大鼠，隨機分為再灌注組、右美托咪定組各14只，在灌注組建模前2 h靜脈注射氯化鈉溶液，右美托咪定組建模前2 h靜脈注射右美托咪定，正常組未做處理。

1.3樣本采集 各組大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min,離心半徑10 cm，分離血清-40℃保存。處死大鼠取其心臟組織，將大鼠心臟組織置于丙酮-干冰飽和溶液中，石蠟包埋保存，以便后續指標檢測。

1.4多道生理記錄儀檢測心臟血流動力學水平 將大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉后，分離右頸總動脈，將PE50動脈導管經右頸總動脈插入左心室，固定后用多道生理記錄儀，檢測并記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓下降最大速率(-dp/dt)、左室內壓上升最大速率(+dp/dt)水平。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色和梗死面積檢測 取出包埋后標本，垂直連續切片，將標本脫蠟處理，用蘇木素浸泡、染色，2%鹽酸酒精分化，使用自來水充分清洗，1%濃度伊紅染色，酒精浸泡、脫水，中性樹膠封片，放置顯微鏡下觀察。染色完畢后，用多聚甲醛固定，稱重，ImageJ圖像分析軟件計算大鼠的心肌梗死面積。

1.6酶標分析儀檢測炎癥因子水平 將待測血清按比例稀釋，酶標板添加100 μl待測血清、標準液，震蕩均勻，恒溫箱靜置60 min，每孔加洗滌液浸泡2 min，甩干，反復洗板3次，每孔加40 μl蒸餾水、一抗，混合均勻，恒溫靜置30 min，重復洗滌步驟，每孔加酶標抗體60 μl，37℃靜置15 min，每孔加底物液60 μl，避光靜置10 min，每孔加終止液60 μl。在酶標板450 nm處測吸光值，計算IL-6、CRP、TNF-α水平。

1.7流式細胞儀檢測氧化應激因子水平 取兩個標記為待測管、對照管的試管備用，對照管和待測管分別加100 μl標準液、待測血清和40 μl蒸餾水、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝液，兩管均加有熒光標記物的單克隆抗體，待測管再加有熒光標記物的免疫球蛋白20 μl，恒溫放置30 min，兩管均加溶血劑靜置15 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，反復洗滌2次，添加磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μl懸浮細胞，流式細胞儀檢測MDA、GSH-Px、SOD水平。

1.8Western印跡法檢測CytoC、Caspase-3通路蛋白相對表達量 待測血清用細胞裂解液裂解，測定待測血清中的蛋白濃度，加入適量的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，沸水水浴加熱5 min，以充分蛋白變性，使用NC膜轉模，Western洗滌液漂洗2 min，加Western封閉液，恒溫靜置60 min，加Western一抗稀釋液，恒溫孵育60 min，回收一抗，加洗滌液漂洗5 min，反復洗滌3次，加入Western二抗稀釋液由辣根過氧化物酶(HRP)標記，恒溫孵育60 min，回收二抗，充分洗滌后顯色、成像。

1.9統計學處理 采用SPSS25.0進行重讀測量方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組心房肌組織病理學觀察 正常組心肌組織結構完整、排列整齊，肌原纖維分布規則；再灌注組心肌組織排列稀疏、雜亂，細胞內有明顯水腫，肌原纖維有斷裂現象；右美托咪定組心肌組織排列較緊密，細胞內水腫減輕，肌原纖維斷裂現象明顯改善。見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色觀察(×200)

2.2各組心臟血流動力學水平和梗死面積比較 如表1所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平較低，LVEDP水平較高，具有統計學差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平較高，LVEDP水平較低，具有統計學差異(P<0.05)。與再灌注組比較，右美托咪定組梗死面積較小，具有統計學差異(P<0.05)。

2.3各組炎癥因子水平比較 如表2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組IL-6、CRP、TNF-α水平較高，具有統計學差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組IL-6、CRP、TNF-α水平較低，具有統計學差異(P<0.05)。

2.4各組氧化應激因水平比較 如表2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組MDA水平較高，GSH-Px、SOD水平較低，具有統計學差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組MDA水平較低，GSH-Px、SOD水平較高，具有統計學差異(P<0.05)。

表1 各組心臟血流動力學水平和梗死面積比較

表2 各組炎癥因子、氧化應激水平比較

2.5各組線粒體凋亡通路蛋白相對表達量對比 如表3、圖2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組各蛋白表達量較高，具有統計學差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組各蛋白表達量較低，有統計學差異(P<0.05)。

表3 各組線粒體凋亡通路蛋白相對表達量對比

1～3：正常組、再灌注組、右美托咪定組圖2 各組線粒體凋亡通路蛋白表達

3 討 論

心肌缺血是由于冠狀動脈狹窄、痙攣、栓塞等引起的心肌供血、供氧不足，主要分為心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、猝死四個類型〔8〕。心肌缺血確診后需長期治療，患者主要表現為心悸、頭暈、胸悶等常伴隨全身乏力、水腫、發熱甚至引發休克，嚴重威脅患者的生命〔9,10〕。臨床常用藥物對患者治療，但由于心肌缺血發病機制復雜，尚無特效藥，因此尋找安全有效藥物是治療心肌缺血的關鍵〔11〕。

梗死面積是判定心肌缺血再灌注損傷的公認指標，心肌梗死是心肌組織的不可逆損傷，故心肌缺血再灌注大鼠模型梗死面積越大，表明其心肌組織的損傷度越高〔12,13〕。本文研究表明，使用右美托咪定處理大鼠，能有效減少大鼠梗死面積，提升心肌缺血再灌注大鼠的心肌保護力。

右美托咪定是一種具有強效、高選擇性的α2腎上腺素受體激動藥物，有鎮靜、鎮痛、穩定血流動力學、呼吸抑制較輕的特點〔14〕。有學者研究表示，右美托咪定+咪達唑侖聯合用藥有助于緩解體內炎癥反應，從而有效減輕心肌組織的損傷〔15〕。右美托咪定可通過調控IL-6、IL-3、LVSP、LVEDP水平，減輕心肌缺血再灌注過程中炎癥反應的發生，提高機體血流動力學水平，從而起到保護心肌組織的作用〔7〕。分析其原因可能是由于炎癥反應可參與心肌損傷的過程相關，當炎癥因子水平被抑制后，其心肌組織的損傷可明顯減輕，心室功能得到明顯改善；心臟血流動力學水平的提升，可使心臟供血、供氧能力提升，從而弱化其損傷的過程〔16〕。本文研究表明，經右美托咪定處理后，心肌缺血再灌注大鼠血流動力學水平提升、炎癥因子水平下降，從而使心肌組織損傷明顯降低，進而抑制心肌組織進一步損傷，促進其相關功能的修復。

線粒體是調節大部分凋亡通路的細胞器，可通過多種應力刺激激活，導致線粒體外膜的改變〔17〕。CytoC由CYCS基因編碼，是一種高度保守的蛋白質，從線粒體泄露出CytoC可誘導細胞凋亡；Caspase-3屬于Caspase家族，是細胞凋亡的效應器，與眾多底物作用，導致凋亡細胞發生特有改變〔18,19〕。目前已有研究顯示，促凋亡蛋白CytoC的增加和釋放可激活Caspase-3的活性，可導致心肌細胞的凋亡，最終導致心臟功能損傷〔20〕。本研究結果表明右美托咪定可能經促進線粒體凋亡通路相關蛋白失活，有效阻止心肌細胞的程序性死亡，從而保護心肌細胞。

雖然本文結果顯示，右美托咪定可能通過促進線粒體凋亡通路失活，抑制心肌組織損傷，但目前臨床研究并沒有顯示右美托咪定、促進線粒體凋亡通路與心肌缺血再灌注的關系，且本研究例數較少，存在一定的局限性，因此該結果仍需進一步證實，以期為臨床心肌缺血再灌注的診治提供新的思路。

綜上所述，使用右美托咪定對心肌缺血再灌注大鼠進行治療，能有效改善心臟血流動力學水平，緩解炎癥反應的發生，提高機體抗氧化能力，減少梗死面積，其作用機制可能促使線粒體凋亡通路信號通路失活。