靶向沉默MALAT-1聯(lián)合化療對(duì)人喉鱗癌裸鼠移植瘤Fas/FasL信號(hào)通路的影響

王帥帥 許堯生 張義

(衡水市人民醫(yī)院，河北 衡水 053100)

喉癌是一種來(lái)源于喉黏膜上皮組織的惡性腫瘤，原發(fā)部位在喉部，以鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，好發(fā)年齡為50～70歲，男性較為多見(jiàn)〔1〕。其發(fā)生與長(zhǎng)期酗酒、吸煙、有害物質(zhì)的吸入及乳頭狀瘤病毒入侵感染有關(guān)，由于該病發(fā)病較隱匿，患者就診時(shí)往往已發(fā)展為中晚期。喉鱗癌的發(fā)病率較高，在耳鼻喉科中僅次于鼻咽癌和鼻竇癌，居第三位〔2,3〕。喉鱗癌的癥狀為呼吸及吞咽困難、咳嗽、聲嘶、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，臨床治療主要采用手術(shù)或聯(lián)合放化療方式，但也會(huì)不同程度地降低患者喉部功能而導(dǎo)致生活質(zhì)量的下降〔4〕。近年來(lái)放射性治療廣泛應(yīng)用于晚期喉癌患者和保留喉部功能的多學(xué)科治療中，但也有少數(shù)患者在臨床治療中出現(xiàn)輻射抵抗，治療效果不佳〔5〕，因此急需探索新的治療方案提高治療敏感性。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一段由哺乳動(dòng)物基因組轉(zhuǎn)錄形成的非編碼RNA，它在人體不同細(xì)胞和組織中的表達(dá)量有所不同，在多種癌組織中異常表達(dá)，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子(MALAT)-1是LncRNA家族中的一位重要成員，可參與喉癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程〔6〕。細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤有負(fù)調(diào)節(jié)作用，凋亡信號(hào)的異常可導(dǎo)致人體集體平衡發(fā)生紊亂，從而降低癌細(xì)胞死亡率，而Fas/FasL信號(hào)作為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的成員之一，可促進(jìn)凋亡〔7〕。喉癌細(xì)胞中Fas和FasL的表達(dá)比正常細(xì)胞低，因此可用于檢測(cè)癌癥患者的病情狀況〔8〕。關(guān)于喉癌與MALAT-1及其具體機(jī)制的研究較少，因此本文探究靶向沉默MALAT-1聯(lián)合化療對(duì)人喉鱗癌裸鼠移植瘤Fas/FasL信號(hào)通路的水平變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1材料和試劑 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所購(gòu)得人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2，培養(yǎng)條件為杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)+10%胎牛血清+青霉素+鏈霉素，在37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。順鉑注射液(云南植物藥業(yè)有限公司)，規(guī)格：2 ml/10 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字(H53021740)。

1.2MALAT-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，第1對(duì)引物用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)調(diào)取擴(kuò)增目的基因：正義鏈5′-GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3′；反義鏈5′-AUAAAUCCCUUUACACCUCTTT-3′。第2對(duì)引物根據(jù)載體本身序列和目的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因MALAT-1 cDNA片段，經(jīng)過(guò)消化、切割、連接，再轉(zhuǎn)化、涂板、挑取克隆、擴(kuò)增，用試劑盒提取質(zhì)粒、酶切，最后經(jīng)過(guò)PCR凝膠電泳鑒定，測(cè)定序列驗(yàn)證后得到純化的MALAT-1重組質(zhì)粒。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后接種于6孔板，每孔1×106個(gè)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至80%左右時(shí)，更換無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為兩組：空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，采用LipofectamineTM2000試劑盒將空白對(duì)照組加入Opti-MEM，實(shí)驗(yàn)組加入MALAT-1 siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后收集MALAT-1轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4建立裸鼠模型 選擇28只雄性、5周齡的Balb/c健康裸鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將裸鼠分為兩組，分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染MALAT-1的Hep-2細(xì)胞以每只2×106個(gè)細(xì)胞注射于裸鼠的頸背部，在凈化空氣層的隔離室中繼續(xù)飼養(yǎng)，給予滅菌處理過(guò)的水和飼料。待裸鼠的移植瘤直徑達(dá)到8～10 mm時(shí)表明移植瘤成功。選取腫瘤大小均勻的裸鼠20只，其中轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染MALAT-1重組載體的裸鼠各10只，將兩組再隨機(jī)分為2組，共4組，每組5只。分組為：Ⅰ重組載體+順鉑組，Ⅱ重組載體組，Ⅲ順鉑組和Ⅳ空白對(duì)照組。其中Ⅰ、Ⅱ組為轉(zhuǎn)染MALAT-1載體組。向Ⅰ和Ⅲ組每只注射劑量為2 mg/kg的順鉑，Ⅱ和Ⅳ組分別注射等分體積的生理鹽水，所有組隔天注射一次，注射2 w后采用頸椎脫位法將裸鼠脫頸處死，解剖取裸鼠腫瘤組織，放于4%甲醛中固定，采集數(shù)據(jù)并處理。

1.5觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1移植瘤體積變化 在給藥過(guò)程中每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，并計(jì)算腫瘤體積(V)，V=1/2ab2。

1.5.2MALAT-1表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)4組細(xì)胞MALAT-1中mRNA表達(dá)水平。取出收集的腫瘤組織，反復(fù)研磨使組織充分裂解。根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞的總RNA，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再進(jìn)行PT-PCR反應(yīng)，使用SYBR試劑盒進(jìn)行操作：SYBR Premix 10 μl，H2O 8 μl，cDNA 1 μl，正反向游引物各0.5 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共計(jì)30次循環(huán)。采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算MALAT-1中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3磷酸化蛋白(p-PI3K)和絲氨酸蛋白激酶(p-Akt)蛋白表達(dá) 采用Western印跡法檢測(cè)4組中p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)情況。稱(chēng)取40 mg腫瘤組織，切碎后用勻漿機(jī)勻漿，離心得到上清液。提取總蛋白，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒檢測(cè)p-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和p-蛋白激酶B(Akt)的蛋白表達(dá)量。將蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶4的比例混勻上樣，加入樣品指示劑升高電壓至120 V，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜完成后用脫脂牛奶封閉90 min，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，用Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)清洗后加入二抗，90 min后顯色，采用Tanon600圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.5.4Fas和FasL基因表達(dá) 采用qRT-PCR檢測(cè)各組腫瘤組織中Fas和FasL蛋白的表達(dá)情況。稱(chēng)取40 mg腫瘤組織，在研磨器中將腫瘤組織研磨成粉末，加入Trizol裂解細(xì)胞。然后擴(kuò)增Fas和FasL片段，經(jīng)染色后掃描各條帶的吸光度值，并計(jì)算mRNA水平相對(duì)值。

1.5.5Ki67指數(shù)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組中的數(shù)和HIF-1α的表達(dá)情況。摘取裸鼠腫瘤后，用4%的甲醛固定24 h后，將腫瘤組織切成Ki67指厚為5 μm的小塊，再次固定30 min，用流動(dòng)水沖洗1 h，放入自動(dòng)脫水機(jī)逐漸脫去水分，置于二甲苯中，再進(jìn)入浸蠟過(guò)程，用石蠟對(duì)腫瘤進(jìn)行包埋，用鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶鏈接(SP)法進(jìn)行免疫組化染色，采用的一抗為鼠抗HIF-1α和鼠抗Ki67(中杉金橋生物公司)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為一抗的陽(yáng)性對(duì)照。每張腫瘤切片在400倍高倍鏡下選取至少5個(gè)視野，每個(gè)視野選取100個(gè)細(xì)胞，Ki67指數(shù)為每張切片陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞占比百分?jǐn)?shù)。陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為棕褐色或棕黃色，陰性表達(dá)細(xì)胞不顯色。

在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)存在HIF-1α蛋白，HIF-1α蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色，染色程度按照免疫組化半定量分析〔9〕的方法，每張腫瘤切片在400倍高倍鏡下選取至少5個(gè)視野，每個(gè)視野選取100個(gè)細(xì)胞，參照陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例進(jìn)行計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度也分為4個(gè)等級(jí)：細(xì)胞基本未見(jiàn)著色為0分，著色為淡黃色為1分，著色為黃色為2分，著色為棕褐色為3分。最終HIF-1α表達(dá)評(píng)分結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度得分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1移植瘤體積比較 治療前，4組移植瘤體積相近(P>0.05)，治療2 w后，相比Ⅳ組，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤體積均明顯低于Ⅳ組，其中Ⅰ組移植瘤體積減小程度最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 移植瘤體積、MALAT-1 mRNA及p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較

2.2MALAT-1mRNA表達(dá)水平比較 治療后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤組織中MALAT-1 mRNA的表達(dá)水平顯著低于Ⅳ組，其中Ⅰ組MALAT-1 mRNA的表達(dá)水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平比較 治療后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤組織中p-PI3K和p-Akt表達(dá)水平均顯著低于Ⅳ組，其中Ⅰ組各水平最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4Fas指數(shù)和FasL基因表達(dá)水平比較 治療后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤組織中Fas指數(shù)和FasL基因表達(dá)水平均高于Ⅳ組，其中Ⅰ組Fas指數(shù)和FasL基因表達(dá)水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5Ki67指數(shù)和HIF-1α表達(dá)水平比較 治療后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腫瘤組織中Ki67指數(shù)和HIF-1α表達(dá)水平均低于Ⅳ組，其中Ⅰ組Ki67和HIF-1α基因表達(dá)水平最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Fas指數(shù)、Ki67指數(shù)、FasL基因及 HIF-1α表達(dá)水平比較

3 討 論

喉癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，非手術(shù)療法相比手術(shù)可更直接保留患者喉部的正常生理功能，而放化療是更有效的治療方式〔10〕。放化療是治療喉癌和復(fù)發(fā)性喉癌的主要治療手段，然而由于組織細(xì)胞周期、低氧等原因而改變細(xì)胞的生存環(huán)境，常導(dǎo)致喉癌對(duì)化療不敏感而產(chǎn)生耐藥〔11〕。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療產(chǎn)生耐藥的主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡產(chǎn)生耐受，細(xì)胞中的凋亡因子如B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白的高表達(dá)可控制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞降低對(duì)化療藥物的敏感性〔12〕。

MALAT-1是位于人染色體的一個(gè)基因片段，可參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等生理過(guò)程，但其與信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性及具體的作用機(jī)制至今尚未得到闡明〔13〕。有研究顯示，腫瘤組織中MALAT-1呈高表達(dá)水平，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期過(guò)程而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖〔14〕。研究表明〔15〕干擾MALAT-1的水平可通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞的G0/G1周期進(jìn)而降低前列腺癌的增殖率，使細(xì)胞凋亡率顯著升高。本研究結(jié)果顯示，靶向MALAT-1聯(lián)合化療可有效降低MALAT-1在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，對(duì)治療喉癌更為有效，與譚建成等〔16〕研究一致。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑越大，其腫瘤組織中MALAT-1水平越高，而靶向沉默MALAT-1可有效促進(jìn)喉癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，證實(shí)MALAT-1參與喉癌細(xì)胞的增殖過(guò)程〔17〕。順鉑是治療卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、喉鱗癌等多種實(shí)體腫瘤的常用化療藥物，主要作用靶點(diǎn)為DNA，有研究顯示，當(dāng)用RNAi下調(diào)MALAT-1后，某些腫瘤細(xì)胞將對(duì)順鉑的化療敏感性提高，抑制細(xì)胞的增殖〔18〕，因此靶向沉默MALAT-1聯(lián)合化療可有效抑制喉癌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)。

PI3K/Akt信號(hào)通路也是一條抑制凋亡的重要通路，活化后的PI3K可激活下游蛋白Akt，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游中其他凋亡相關(guān)基因，抑制細(xì)胞中的神經(jīng)元發(fā)生凋亡。研究顯示PI3K/Akt信號(hào)通路在促進(jìn)咽喉部的腫瘤增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔19〕，因此下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路可有效阻滯喉癌細(xì)胞的增殖。本研究顯示下調(diào)MALAT-1可干擾PI3K/Akt信號(hào)通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。順鉑作為一期治療常用的化療藥物，可以激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抑制細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致耐藥〔20〕。而MALAT-1沉默后可干擾PI3K/Akt信號(hào)通路，使Caspase-3和Caspase-9磷酸化而失活，抑制Caspase導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)耐藥，增強(qiáng)化療藥物順鉑的細(xì)胞毒性，增加化療效果〔21〕。

細(xì)胞凋亡還有一條由Fas與FasL結(jié)合的主要通路，F(xiàn)as屬于腫瘤壞死因子受體家族中的成員之一，是細(xì)胞表面的受體，F(xiàn)as在正常情況下表達(dá)于人各種組織和器官中，但在人腫瘤組織中Fas表達(dá)受到限制，出現(xiàn)表達(dá)功能喪失〔22〕。FasL是Fas的天然配體，分子量為40 kD，小鼠的Fasl基因與人類(lèi)有高達(dá)76.9%的同源性。Fas與配體FasL結(jié)合后，能誘導(dǎo)Fas分子形成三聚體，這種三聚體可傳遞各種信號(hào)，啟動(dòng)T細(xì)胞產(chǎn)生凋亡信號(hào)，激活Caspase 1、3、6、7從而引起細(xì)胞的凋亡〔23〕。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞是通過(guò)Fas/FasL信號(hào)通路為基礎(chǔ)的。其機(jī)制可能是腫瘤細(xì)胞中的Fas與FasL結(jié)合后，凋亡途徑被激活，細(xì)胞的自我凋亡效果明顯。但研究者檢測(cè)出大量喉癌、肺癌患者腫瘤組織中Fas表達(dá)量顯著低于癌旁組織和正常人體組織〔24〕，因此需要采取有效的治療措施提高癌細(xì)胞中Fas的表達(dá)，通過(guò)Fas/FasL信號(hào)系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究顯示〔25〕，癌癥患者應(yīng)用順鉑后，能上調(diào)Fas和FasL mRNA的表達(dá)，隨著Fas的表達(dá)水平上調(diào)，宿主淋巴細(xì)胞的凋亡數(shù)量也明顯增加。而靶向沉默MALAT-1也可以上調(diào)Fas/FasL系統(tǒng)，因此將兩者聯(lián)合治療起到協(xié)同作用，與本研究結(jié)果一致。

HIF-1α是對(duì)缺氧狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵因子，在機(jī)體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧平衡，激活缺氧反應(yīng)基因的表達(dá)，對(duì)維持腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移起到重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)其在人鼻咽癌、喉鱗癌中都有不同程度的較高表達(dá)水平，而抑制HIF-1α表達(dá)可有效改善喉鱗癌等癌癥的化療抵抗〔26〕。Ki67指數(shù)可作為腫瘤預(yù)后指標(biāo)，其表達(dá)水平與腫瘤組織分化程度成正相關(guān)，在喉鱗癌等組織中表達(dá)呈陽(yáng)性〔27〕。本研究顯示，聯(lián)合用藥后可顯著下調(diào)Ki67和HIF-1α的表達(dá)水平。有研究顯示〔28〕，隨著順鉑濃度的升高，Ki67的表達(dá)顯著減弱，成劑量依賴(lài)性，原因可能是Ki67是與細(xì)胞增殖有關(guān)的抗原，而順鉑抑制細(xì)胞的增殖過(guò)程，從而影響Ki67的表達(dá)水平。同時(shí)靶向沉默MALAT-1也可通過(guò)調(diào)控下游信號(hào)通路中Capase-3的活性而影響Ki67和HIF-1α的表達(dá)〔29〕。