蛇床子素通過PI3K/Akt/mTOR通路對糖尿病腎病大鼠纖維化及HSP90、SIRT1的影響

王曉偉 余小柱 郭二霞 王會霞 高華山

(1平頂山學院，河南 平頂山 467092；2平頂山市中醫院；3平頂山市第五人民醫院)

糖尿病腎病是造成終末期腎衰竭的主要因素，主要表現為腎功能降低和蛋白尿增加〔1〕。細胞自噬活化與糖尿病腎病的好轉有重要關系，而細胞自噬受條件影響對細胞凋亡既可以促進也可以抑制，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)蛋白增加可激活哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)通路，進而抑制細胞自噬作用〔2〕。中晚期腎病的病理學基礎主要是腎臟纖維化〔3〕。沉默信息調節因子(SIRT)1存在于細胞核中，廣泛表達于哺乳動物的成熟器官中，對細胞損傷和器官具有較好的保護作用〔4〕。熱休克蛋白(Hsp)90屬于保守性較高的伴侶分子，廣泛存在于生物體內，可通過結合功能蛋白保證蛋白分子能正常折疊并維持其功能〔5〕。蛇床子素是從中藥蛇床子中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，且對肝細胞的增殖分化具有明顯的促進作用〔6〕。因此本文研究蛇床子素通過PI3K/Akt/mTOR通路對糖尿病腎病大鼠纖維化及HsP90及SIRT1的影響。

1 材料與方法

1.1動物 48只雄性SD大鼠，SFP級，體重(200±20)g，動物許可證號：SYXK(京)2019-0054。

1.2試劑與儀器 蛇床子素(廣東海賽特藥業有限公司，國藥準字Z20191001)；PI3K抗體(Cell Signaling公司)；Akt抗體(Affinit公司)；兔抗SIRT1多克隆抗體(美國LSBio公司)；尿微量白蛋白酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；Anti-Hsp90α和β抗體(Abcam公司)；電泳儀和聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國伯樂公司)。

1.3分組與造模 將大鼠隨機分為6組，每組8只，一組為正常組，其余5組均給予造模。所有大鼠均正常飼養，喂養3 d后，將除正常組外的所有大鼠均給予腹腔注射55 mg/kg鏈脲佐菌素，正常組給予等體積的檸檬酸緩沖鹽。給藥后對大鼠飲食、飲水量和24 h的尿量進行觀察，并于72 h后于大鼠尾尖采血，測定空腹時血糖，檢測尿糖情況，連續3 d，當大鼠空腹血糖高于16.7 mmol/L或隨機血糖大于22.2 mmol/L，表示尿糖為強陽性，尿量比正常組尿量多150%，且連續3 d達到上述標準，表示糖尿病大鼠造模成功。將造模后大鼠隨機分為5組：模型組、不同劑量治療組(分別灌胃蛇床子素1、10、20和50 mg/kg)，正常組和模型組分別給予相同體積的生理鹽水。

1.4觀察參數 分別于給藥前和給藥8 w后，測定大鼠血糖變化；收集大鼠24 h的尿液，測定24 h尿微量白蛋白；取血檢測大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，并計算肌酐清除率(Ccr)。采用Western印跡檢測方法，取大鼠腎組織，勻漿，加磷酸鹽緩沖液(PBS)離心后裂解，將總蛋白提取出來，并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒對蛋白的濃度進行測定。然后以actin為內參，通過電泳，轉模，抗體賦予和顯色成像測定PI3K和Akt蛋白相對表達量。

1.5RT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測 取腎組織勻漿后提取總RNA，通過逆轉錄合成cDNA并以該cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為95℃變性30 s、預變性5 s，然后60℃退火，30 s，循環40次。計算SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA表達情況。

1.6Western印跡檢測 取腎臟組織，勻漿后離心提取總蛋白，測定蛋白濃度。然后進行電泳、轉模、抗體孵育過夜，電化學發光(ECL)化學發光法成像，測定大鼠SIRT1、Hsp90α和Hsp90β 蛋白表達情況。采用ImageJ軟件進行半定量。

1.7腎臟組織病理染色 實驗結束時，取部分腎臟組織，多聚甲醛固定，脫水，包埋石蠟，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，用后置光學顯微鏡觀察腎臟的病理情況。

1.8腎纖維化檢測 采用Western印跡檢測纖維化相關蛋白：腎臟Ⅳ型膠原蛋白、纖聯蛋白(FN)、基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(TIMP)-1和MMP-9，具體步驟如下：勻漿，裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，電泳、轉模、加抗體室溫孵育2 h，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，ECL化學發光法顯影，采用ImageJ軟件進行半定量。

1.9統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組血糖和尿微量白蛋白水平變化 模型組血糖和尿微量白蛋白均顯著高于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組上述參數與模型組相比均顯著降低(P<0.05)，且具有劑量依賴性。見表1。

表1 各組血糖、尿微量白蛋白、Scr、BUN、Ccr、PI3K及Akt水平變化

2.2各組Scr、BUN和Ccr水平變化 模型組Scr和BUN水平顯著高于正常組，Ccr水平顯著低于正常組水平(均P<0.05)；與模型組相比，蛇床子素不同劑量組Scr和BUN水平均降低，Ccr水平均增加，當劑量達到20和50 mg/(kg·d)時顯著(P<0.05)。見表1。

2.3各組PI3K和Akt蛋白表達 模型組PI3K和Akt水平顯著高于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組與模型組相比，PI3K和Akt水平均降低，且具有劑量依賴性，劑量達到10、20、50 mg/(kg·d)時PI3K明顯降低(P<0.05)，劑量達到1、10、20、50 mg/(kg·d)時，Akt明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1。

2.4各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA表達模型組SIRT1 mRNA表達水平顯著低于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組與模型組相比，SIRT1 mRNA表達水平均顯著增加(P<0.05)；各組Hsp90α和Hsp90β mRNA表達水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2。

1～6：正常組、模型組、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg組圖1 各組PI3K和Akt蛋白表達

表2 各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β mRNA及腎臟Ⅳ型膠原蛋白、FN、TIMP-1、MMP-9蛋白表達

2.5各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β蛋白表達 模型組SIRT1 蛋白表達水平顯著低于正常組(P<0.05)，蛇床子素不同劑量組與模型組相比，SIRT1 蛋白表達水平均顯著增加(均P<0.05)；各組Hsp90α和Hsp90β 蛋白表達水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2、圖2。

1～6：正常組、模型組、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg組圖2 各組SIRT1、Hsp90α和Hsp90β蛋白表達

2.6各組腎纖維化情況 與正常組相比，模型組腎臟Ⅳ型膠原蛋白、FN和TIMP-1水平顯著增加，MMP-9顯著降低，蛇床子素不同劑量組腎臟Ⅳ型膠原蛋白、FN和TIMP-1水平均顯著低于模型組，MMP-9水平顯著高于模型組水平(P<0.05)，且呈現劑量依賴性。見表2、圖3。

1～6：正常組、模型組、蛇床子素1、10、20、50 mg/kg組圖3 各組腎纖維化相關蛋白表達水平

2.7各組腎臟組織病理情況 與正常組比較，模型組腎小球肥大，腎小球數量增加，伴有腎小球系膜擴張和基底膜厚度增加，腎小管有空泡變形。蛇床子素不同劑量組腎小球肥大、增生及系膜擴張和基底膜變后現象均較輕，其中高劑量治療組改善最顯著。見圖4。

圖4 各組腎臟組織病理(HE染色，×400)

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病主要的慢性微血管并發癥，主要病理包括腎小球基底膜便后和系膜擴張、腎小球硬化、腎小管空泡變性及腎間質纖維化〔7〕。研究發現腎臟細胞自噬對糖尿病腎病具有改善作用，影響自噬作用的信號通路有多種，通過增加上游PI3K/Akt蛋白表達水平可激活mTOR通路，進而對細胞自噬起到一定的調節作用〔8，9〕。以往研究結果顯示蛇床子素可以降低糖尿病模型大鼠p-Akt蛋白的表達水平，而使用PI3K抑制劑后對p-Akt蛋白的表達水平有抑制作用，證明蛇床子素對PI3K/Akt/mTOR通路具有抑制作用〔10〕。與本研究結果一致。

Scr是內生肌酐，在反映患者腎損傷方面準確度較高，是腎功能變化的重要參考指標，其被腎小球率過后可隨尿液被排出，且與尿量無關，患者腎損傷時Scr水平增加〔11〕。BUN屬于體內蛋白代謝產物，在血液中以小分子形式存在，經腎小球過濾進原尿，之后大部分又被腎小管重吸收，當腎受損時，導致血中BUN水平升高〔12〕。Ccr是評價腎功能的重要參數，可用于評估腎小球的濾過率〔13〕。本研究結果提示，蛇床子素抑制了PI3K/Akt/mTOR通路，激活腎臟細胞自噬保護機制，改善腎臟病理及腎功能。

腎臟Ⅳ型膠原蛋白和FN可導致腎間質纖維化和腎小球硬化〔14，15〕。MMP-9與腎纖維化具有密切關系，細胞外基質累積會引起腎小球硬化和腎纖維化，而MMP-9對細胞外基質的降解具有促進作用〔7，16〕。TIMP對MMP-9的活性具有抑制作用，進而維持細胞外基質降解和沉積兩者之間的平衡〔17～19〕。本研究結果提示，蛇床子素可通過PI3K/Akt/mTOR通路對改善糖尿病腎病大鼠纖維化。

SIRT1是乙酰化酶組蛋白家族的基因，廣泛表達于成熟器官中，可調節能量代謝，具有抗氧化、抗感染及抗細胞凋亡作用，可通過調節信號通路保護細胞，維持器官功能，降低細胞損傷〔20，21〕。Hsp90具有良好的蛋白折疊及功能維護作用，可有效抵抗熱應激和氧化作用對蛋白功能的影響，包括Hsp90α和Hsp90β兩個亞型，其在內皮細胞、細胞骨架和細胞核中均有存在〔22〕。本研究結果提示，蛇床子素上調糖尿病腎病大鼠SIRT1表達水平。主要原因是蛇床子素可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路降低腎臟細胞損傷，起到抗感染和抗氧化作用，進而保護腎臟細胞〔23〕。

綜上，蛇床子素可以降低糖尿病腎病大鼠尿微量白蛋白，降低腎組織病理損傷，可能與PI3K/Akt/mTOR通路有關，且可以上調SIRT1表達水平，降低腎纖維化，對HSP90表達水平無明顯關系。