響應面法優化植物乳桿菌發酵板栗復合飲料

靳羽慧，曹 蒙，劉東咪，周 楓，張靜華，李建芳

（1. 信陽農林學院 食品學院，河南 信陽 464000；2. 信陽名宴實業有限公司，河南 信陽 464000）

板栗是我國有名的傳統農副產品，風味獨特、營養價值豐富[1]。河南省信陽地區是我國板栗之鄉，每年所生產板栗種類和數量高達幾十萬公斤，形成東雙河板栗貿易市場等多個主要的大型板栗貿易市場，有關板栗種類和產品的研發、加工也日趨完善[2]。板栗中含有大量的可溶性糖、蛋白質、多種礦物質和維生素，具有養胃健脾、止血消腫、強筋健骨的功效，對高血壓、冠心病等疾病具有較好的防治作用[3-4]。

紅棗作為特色果實，其營養價值豐富，含有較多的生物活性物質，可以提高人體免疫力，含有的多糖和多酚物質，均為抗氧化劑，可清除自由基，達到延緩衰老的作用[5]。紅棗含有的蘆丁可以軟化血管、降低血壓，提高血清蛋白、降低膽固醇[6]。含有的鈣和鐵對預防骨質疏松及貧血具有很重要的作用[7]。

植物乳桿菌屬于革蘭氏陽性菌株，是不產生芽孢的兼性厭氧性乳酸菌，30~35 ℃是最佳生長溫度[8]。植物乳桿菌可以利用葡萄糖、果糖及乳糖等為原料進行新陳代謝而產酸。在發酵食品分布更廣，常被用于改進食品營養價值，如香腸、面包、葡萄酒和酸奶等[9]。同時，也是人體腸道內的益生菌群，改善人們的腸胃環境，對人體健康有很大促進作用[10]。有關研究表明，當攝入一定量的植物乳桿菌或其發酵食品，對人體有特定的益生保健功能[11-12]。植物乳桿菌ST-Ⅲ是一株從泡菜中篩選出來的益生菌，可調節腸道微生物菌群的平衡，增強機體的免疫力，降低膽固醇和調節血脂、降脂等益生功能[13]。植物乳桿菌ST-Ⅲ有較強耐受低pH 值能力，在較高pH 值的條件下存活能力更強[14]。此菌株發酵使產品在具備板栗和紅棗特有香味的基礎上，提高營養價值，口感更加獨特的一款功能性飲料[15-16]。

以板栗和紅棗為試材，添加檸檬酸、白砂糖等輔料，接入植物乳桿菌ST-Ⅲ進行發酵，利用響應面法對接種量、發酵溫度和發酵時間進行優化試驗。以期為我國植物乳桿菌發酵飲料方面提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

板栗，信陽市潤海板栗貿易有限公司提供；和田大棗，山西昌吉市金品誠商貿有限公司提供；白砂糖，購自信陽西亞超市；檸檬酸（無水），鄭州億之源化工產品有限公司提供；植物乳桿菌ST- Ⅲ（Lactobacillus plantarum） 凍干粉，鄭州百益寶生物技術有限公司提供。

1.2 主要設備

LDZM-60KCS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品；DHP-260 型電熱恒溫培養箱，上海梅香儀器有限公司產品；JY10002 型電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司產品；YL-Y912 型高速破壁調理機，九陽股份有限公司產品；WYT-J 型手持折光儀，成都豪創光電儀器有限公司產品；PHSJ-3F 型pH 測量儀，濟南歐萊博技術有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

①挑選→脫殼→加入0.11%檸檬酸溶液打漿→煮漿→過濾→板栗汁；

②紅棗汁制備。挑選→水煮→打漿→過濾→紅棗汁；

①+②→混合→復配→殺菌→冷卻→灌裝→接種→發酵→121 ℃保持15 min 滅菌→冷卻至80 ℃→封蓋成品。

1.3.2 單因素試驗

（1） 植物乳桿菌接種量對復合飲料感官品質的影響。以板栗汁∶紅棗汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味劑充分攪拌均勻，植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量分別為1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，在35 ℃下發酵48 h，對發酵后的飲料進行感官評價。

（2） 植物乳桿菌發酵溫度對復合飲料感官品質的影響。以板栗汁∶紅棗汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味劑充分攪拌均勻，接入3.0%植物乳桿菌ST-Ⅲ，分別在發酵溫度25，30，35，40，45 ℃下發酵48 h，對發酵后的飲料進行感官評價。

（3） 植物乳桿菌發酵時間對復合飲料感官品質的影響。以板栗汁∶紅棗汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味劑充分攪拌均勻，接入3.0%植物乳桿菌ST-Ⅲ，控制發酵溫度35 ℃，分別發酵24，36，48，60，72 h，對發酵后的飲料進行感官評價。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選擇植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量、發酵溫度和時間3 個考查因素，以感官評分為響應值，根據Box-behnken 設計中心試驗原理，采用Design Expert10.0 響應面設計三因素三水平試驗。

Box-behnken 試驗因素與水平見表1。

表1 Box-behnken 試驗因素與水平

1.3.4 感官評定方法

選擇10 名食品相關專業有品評經驗人員組成評定小組，依據板栗復合飲料感官評分標準[17]（見表2），從板栗復合飲料的外觀色澤、組織結構、滋味及風味4 個方面進行綜合感官評分，滿分為100 分，取平均值。

板栗復合飲料感官評分標準見表2。

表2 板栗復合飲料感官評分標準

1.3.5 理化指標測定

（1） 總酸。符合GB/T 12456—2008 標準，采用指示劑法檢測樣品中的總酸含量。

（2） pH 值。符合GB 19297—2003 標準，采用pH 測定儀。

（3） 可溶性固形物。符合GB/T 12143—2008 標準，采用手持式折光儀（20 ℃）。

（4） 菌落總數。符合GB 4789.2—2016 標準，采用平板計數法。

1.3.6 數據分析使用Origin 9.0 軟件和Design Expert 10.0 響應面分析軟件，對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 接種量對板栗復合飲料發酵的影響

在板栗紅棗汁中，分別接入不同添加量1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%的植物乳桿菌ST-Ⅲ，在35 ℃下恒溫發酵48 h，對其進行感官評分。

接種量對飲料感官評分的影響見圖1。

圖1 接種量對飲料感官評分的影響

由圖1 可知，隨著植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量的增加，板栗復合發酵飲料的感官評分先上升后下降。當植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量小于3%時，板栗復合發酵飲料口感風味偏甜，組織狀態不均勻，且有分層現象。當接種量達到3%時，感官評分最高，為85 分。此時飲料色澤呈咖啡色，口感較為細膩、酸甜適中。當接種量高于3%時飲料口感偏酸，發酵風味過于濃厚，板栗紅棗香味風味不協調。汪云陽等人[18]以枸杞原漿為原料，研究出當植物乳桿菌CGMCC8198 接種量為2%枸杞發酵飲料風味最佳。綜合考查，試驗選取接種量2%~4%為進一步優化范圍。

2.1.2 發酵溫度對板栗復合飲料發酵的影響

將3%植物乳桿菌ST-Ⅲ接入于板栗紅棗汁中，分別在25，30，35，40，45 ℃條件下發酵48 h，對其進行感官評分。

發酵溫度對飲料感官評分的影響見圖2。

圖2 發酵溫度對飲料感官評分的影響

由圖2 可知，隨著發酵溫度的升高，板栗復合飲料的感官評分呈現先上升后下降趨勢。當發酵溫度低于30 ℃時，板栗復合飲料組織狀態基本穩定，板栗紅棗香氣混合均勻，口感略微粗糙，不順滑；當發酵溫度為30 ℃時，飲料中紅棗和板栗的混合香味最佳，色澤較為均勻，口感細膩，酸甜可口，且感官評分最高，為91 分。發酵溫度過低或過高均不利于植物乳桿菌ST-Ⅲ的生長，會導致發酵風味欠佳，色澤較淺，酸甜略有不適。綜合考查，試驗選取發酵溫度25~33℃為進一步優化范圍。

2.1.3 發酵時間對板栗復合飲料發酵的影響

將3%植物乳桿菌ST-Ⅲ接入于板栗紅棗汁中，在30 ℃恒溫條件下，分別發酵24，36，48，60，72 h，對其進行感官評分。

發酵時間對飲料感官評分的影響見圖3。

圖3 發酵時間對飲料感官評分的影響

由圖3 可知，隨著發酵時間繼續延長，板栗復合飲料的感官評分出現先上升后急速下降。當發酵時間低于48 h 時，由于發酵時間不充分，飲料口感略甜，混合香氣不協調，組織狀態基本均勻；發酵時間為48 h 時感官評分高達93 分，此時產品口感細膩順滑，板栗紅棗的香氣混和均勻，無異味，顏色均勻一致。當發酵時間大于48 h 時，發酵的飲料口感過酸，發酵味道過濃，產生不良的風味，色澤暗沉、組織狀態不均勻。綜合考查，試驗選取發酵時間40~56 h 為進一步優化范圍。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 Box- behnken 試驗設計與結果

在單因素試驗結果的基礎上，以植物乳桿菌ST-Ⅲ的接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為自變量，感官評分R為響應值，運用Design Expert 10.0 軟件對板栗紅棗飲料發酵工藝進行響應面設計優化。

響應面試驗的設計與結果見表3，回歸方程方差分析見表4。

表3 響應面試驗的設計與結果

對表4 進行回歸分析，得到的回歸方程為[19-20]：

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性

由表4 可知，回歸模型F=69.10，模型極顯著p<0.000 1，失擬項不顯著p=0.062 4>0.050 0，模型合理。決定因素R2=0.988 9，模型能夠反應響應值的變化，回歸方程擬合良好。回歸模型中的一次項與二次項極顯著p<0.000 1，其對感官評分均有極顯著影響。由F值可以判斷出3 個考查因素對植物乳桿菌ST-Ⅲ板栗復合飲料感官評分結果影響的大小依次為發酵溫度＞接種量＞發酵時間。

表4 回歸方程方差分析

2.2.3 響應面因素交互作用分析

綜合考查交互項對感官評分的影響，使3 個因素里的其中一個因素固定不變，選擇其中任意2 個因素，觀察對感官評分的影響。通過Design Expert 10.0 軟件對表3 的數據進行擬合分析得到等高線圖和響應曲面。

接種量和發酵溫度對感官值影響的響應曲面及等高線圖見圖4。

圖4 接種量和發酵溫度對感官值影響的響應曲面及等高線圖

由圖4 可看出，植物乳桿菌ST-Ⅲ的發酵溫度和發酵時間等高線圖形為橢圓狀，表明接種量和發酵溫度2 個因素之間存在的交互作用較為顯著，感官評分隨著接種量和發酵溫度的增大呈現先上升后下降的趨勢。結合此響應面可以看出，發酵溫度上升的幅度明顯大于接種量的上升幅度，說明發酵溫度對感官評分影響較大。

發酵溫度和發酵時間對感官值影響的響應曲面及等高線圖見圖5。

圖5 發酵溫度和發酵時間對感官值影響的響應曲面及等高線圖

由圖5 可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ的發酵溫度和發酵時間等高線圖形呈橢圓形狀較明顯，則發酵時間和發酵溫度兩因素之間存在著一定的交互作用。隨著發酵時間和發酵溫度的增加，感官評分呈現出先上升后下降的趨勢，但發酵溫度上升幅度明顯大于發酵時間的上升幅度，說明發酵溫度對感官評分影響較大。

接種量和發酵時間對感官值影響的響應曲面及等高線圖見圖6。

圖6 接種量和發酵時間對感官值影響的響應曲面及等高線圖

由圖6 可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ的接種量和發酵時間的等高線圖呈橢圓狀圖形不明顯，說明發酵時間和接種量兩因素交互作用不顯著。隨著植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量和發酵時間的增加感官評分先上升后下降，結合此響應面可看出，兩因素上升的幅度相近，對感官評分影響相當。

由等高線圖可明顯看出，兩因素之間的交互作用強弱，呈橢圓狀表明兩因素交互作用是否顯著。

3 個因素之間的交互作用及對感官評分的影響和方差分析的結果一致，運用Design Expert10.0 軟件得到該模型的極大值點，即植物乳桿菌ST-Ⅲ發酵板栗復合飲料的最佳工藝條件為接種量2.690%，發酵溫度28.757 ℃，發酵時間48.446 h，得到最大感官評分數為95.077 分。為試驗操作過程中的方便，調整優化發酵條件為接種量2.7%，發酵溫度29 ℃，發酵時間48 h。將優化后的試驗條件進行3 次驗證試驗，對其進行感官評價，得到的感官評分的平均值為94.4 分，與模型預測值誤差0.71%，說明試驗值與預測值吻和良好。因此，Box-behnken 設計的各個因素添加量的方案準確可靠，具有可操作性[21]。

2.3 理化指標與微生物指標

最佳發酵條件下得到的板栗紅棗復合飲料中可溶性固形物含量12.5%，pH 值3.7，總酸質量濃度為10.236 g/L，菌落總數≤100 CFU/mL。

3 結論

以3∶1 的比例復配板栗汁和紅棗汁，接入植物乳桿菌進行發酵，通過單因素試驗及響應面優化法確定板栗復合飲料的最佳工藝條件為接種量2.7%，發酵溫度29 ℃，發酵時間48 h。經過驗證結果表明，在最優發酵條件下的感官評分為94.4 分，與模型預測數據誤差值為0.71%。將飲料灌裝后在高溫條件下滅菌后冷卻至室溫，經觀察無脹罐、無雜菌污染現象，即制得發酵板栗復合飲料成品。

試驗的產品作為乳酸菌發酵型飲料的一種，其飲料特點是植物乳桿菌通過原料底物和發酵過程決定的。由于板栗淀粉含量較高，且不溶于水，試驗在制作過程中沒有做到原料中淀粉較好的利用。板栗果中淀粉的完全利用有待進一步研究。對于板栗發酵型飲料的穩定性，試驗在穩定劑的選擇上采用了檸檬酸單一穩定劑的添加，通過觀察，板栗復合發酵飲料在靜止放置24 h 后，沒有明顯的分層現象，但液面周圍會出現掛壁現象，因此板栗復合飲料的穩定性還需進一步研究。