HPLC 法同時(shí)測(cè)定紅棗中cAMP 和cGMP 含量

侯紅巖，童 心，杜飛云，侯旭杰，2，蒲云峰，2

（1. 塔里木大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2. 南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆葉河源果業(yè)股份有限公司，新疆圖木舒克 843900）

環(huán)腺苷酸（cAMP） 和環(huán)鳥苷酸（cGMP） 屬于核苷酸的衍生物，作為細(xì)胞內(nèi)常見的第二信使，共同參與細(xì)胞內(nèi)的生理生化過程調(diào)節(jié)[1-2]，具有降血糖[3]、抗過敏[4]、保肝護(hù)肝[5]、抑制心血管疾病[6]、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7]等作用。自1980 年Cyong J C 等人[8]首次發(fā)現(xiàn)棗果中含有cAMP 后，大量學(xué)者開展了棗樹及棗果中cAMP 和cGMP 的研究，證實(shí)了cAMP 和cGMP是棗果中重要的生物活性物質(zhì)，并且是已測(cè)高等植物中含量最高的[9-10]。

HPLC 法是紅棗中cAMP 和cGMP 測(cè)定的主要方法，目前文獻(xiàn)中測(cè)定cAMP 和cGMP 的方法，常常需要配制一定濃度的磷酸二氫鉀緩沖液和調(diào)pH 值[11]，流動(dòng)相配制繁瑣，對(duì)儀器操作者的技術(shù)水平要求高，而不利于液相初學(xué)者掌握和使用。雖然也有少量文獻(xiàn)采用甲酸水替代磷酸二氫鉀緩沖液分析了紅棗樣品中cAMP 和cGMP，但其分析周期過長(zhǎng)[12]，或只分析了紅棗中cAMP[13]。因此，以甲醇和甲酸水為流動(dòng)相，優(yōu)化并建立同時(shí)測(cè)定紅棗中cAMP 和cGMP 的HPLC 方法，實(shí)現(xiàn)紅棗中cAMP 和cGMP 的快速、簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確分析，為紅棗中cAMP 和cGMP 的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

紅棗樣品，采摘于塔里木大學(xué)棗資源圃及阿拉爾周邊果園。

1.2 試劑

cAMP 和cGMP 標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.99%），阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；甲酸（色譜純），北京邁瑞達(dá)科技有限公司提供；甲醇（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；其他常規(guī)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 儀器

FD-1-50 型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品； DZKW-D-2 型恒溫水浴鍋，北京市光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；TGL-20M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品； LC-20A型液相色譜、SPD-M20A 型檢測(cè)器、RID20A 型檢測(cè)器，日本島津公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

將紅棗樣品清洗晾干后，去核切塊，然后在-20 ℃下預(yù)凍1 h，真空冷凍干燥36 h 獲得凍干棗塊，再將凍干棗塊用組織破碎機(jī)粉碎，于-20 ℃下貯藏備用。

稱取一定量樣品粉末，再用蒸餾水在室溫下超聲提取30 min，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心15 min，取上清液過0.22 μm 針式濾膜備用。

1.4.2 色譜條件

Spuirsil C18型色譜柱（250×4.6 mm，i.d.），天津迪馬公司產(chǎn)品；流動(dòng)相為甲醇（A） ∶0.5%甲酸水（B）；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別稱取約cAMP 和cGMP 標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，用蒸餾水溶解，定容至50 mL，獲得質(zhì)量濃度約為1 mg/mL 的cAMP 和cGMP 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取cAMP 和cGMP 混 合 標(biāo) 準(zhǔn) 貯 備 液0.05，0.10，0.20，0.30，0.60，1.20， 2.50，5.00 mL 置于100 mL 量瓶中，用蒸餾水定容，得到cAMP 和cGMP 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。參照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積（Y） 對(duì)質(zhì)量濃度（C） 進(jìn)行線性回歸。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（平均值±SD） 表示，利用SPSS 17.0 進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan's 多重比較（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水相（0.5%甲酸水） 比例對(duì)cAMP 和cGMP 保留時(shí)間和峰面積的影響

參照1.4.2 的色譜條件，在流速為0.7 mL/min，設(shè)置不同的水相比例，然后以cAMP 和cGMP 混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC 分析。

水相比例對(duì)cAMP 和cGMP 的保留時(shí)間和峰面積的影響見表1。

表1 水相比例對(duì)cAMP 和cGMP 的保留時(shí)間和峰面積的影響

由表1 可知，水相（0.5%甲酸水） 比例對(duì)cAMP和cGMP 的峰面積影響較小，但對(duì)保留時(shí)間影響較大。隨著水相（0.5%甲酸水） 比例的增加，cAMP 和cGMP 的保留時(shí)間逐漸延后，cAMP 和cGMP 保留時(shí)間的間距逐漸拉大，從83%的0.56 min 增加到95%的1.9 min，說(shuō)明增加水相比例有利于cAMP 和cGMP的分離。在液相色譜分析時(shí)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑或水的比例要符合色譜柱所允許的使用范圍，如普通C18柱要求有機(jī)相比例≥5%[14]。因此，選擇95%的水相（0.5%甲酸水） 作為紅棗中cAMP 和cGMP 分析的流動(dòng)相條件。

2.2 cAMP 和cGMP 的HPLC 色譜圖

參照1.4.2 的色譜條件，以甲醇- 0.5%甲酸水（5∶95，V/V） 為流動(dòng)相，分別對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品和棗樣進(jìn)行分析，獲得cAMP 和cGMP 混合標(biāo)準(zhǔn)品與棗樣的色譜圖。

cAMP 和cGMP 混標(biāo)和棗樣的HPLC 色譜圖見圖圖1。

圖1 cAMP 和cGMP 混標(biāo)和棗樣的HPLC 色譜圖

由圖1 可知，在混合標(biāo)準(zhǔn)品中cAMP 和cGMP 的出峰時(shí)間分別為9.41 min 和11.31 min，棗樣色譜圖在相同的保留時(shí)間處均有色譜峰，且棗樣色譜圖基線平穩(wěn)，說(shuō)明該色譜條件可以用于紅棗中cAMP 和cGMP 的分析。

2.3 紅棗中cAMP 和cGMP 的HPLC 檢測(cè)方法的建立

參照1.4.2 的色譜條件，以甲醇- 0.5%甲酸水（5 ∶95，V/V） 為流動(dòng)相，對(duì)cAMP 和cGMP 的HPLC 檢測(cè)方法的線性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率、檢出限及定量限進(jìn)行了分析。

cAMP 和cGMP 測(cè)定方法的參數(shù)見表2。

表2 cAMP 和cGMP 測(cè)定方法的參數(shù)

由表2 可知，在0.05~50.0 μg/mL 范圍內(nèi)，cAMP和cGMP 的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=30 282X+3 902.1 和Y=24 349X+7 122.7，回歸系數(shù)分別為R2=1.000 0 和R2=0.999 0。該方法中cAMP 和cGMP 的平均回收率分別為95.48%和94.76%，重現(xiàn)性的RSD 分別為2.28%（n=6） 和4.51%（n=6），室溫下放置72 h 穩(wěn)定性的RSD 分別為2.95%（n=12） 和4.18%（n=12）。檢測(cè)限（LOD） 和定量限（QOD） 按照Araujo P[15]的方法計(jì)算，即檢測(cè)限（LOD） 為3×SD/m和定量限（LOQ） 為10×SD/m，其中SD 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，m為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。該方法中cAMP 和cGMP 的檢測(cè)限（LOD） 分別為0.39 μg/mL 和0.88 μg/mL，定量限（QOD） 分別為1.28 μg/mL和2.93 μg/mL。這說(shuō)明該方法適合同時(shí)測(cè)定紅棗中cAMP 和cGMP 含量。

2.4 紅棗樣品中cAMP 和cGMP 含量的測(cè)定

參照1.4.2 的色譜條件，以甲醇- 0.5%甲酸水（5∶95，V/V） 為流動(dòng)相，對(duì)紅棗樣品進(jìn)行分析。

不同品種紅棗中cAMP 和cGMP 含量見表3。

表3 不同品種紅棗中cAMP 和cGMP 含量 / μg·g-1 DW

由表3 可知，10 個(gè)紅棗樣品中均含有cAMP 和cGMP，不同品種的cAMP 和cGMP 含量存在顯著差異（p<0.05）。cAMP 含量由高到低依次為駿優(yōu)、駿棗、灰棗、梨棗、伏脆蜜、冬棗、大白鈴、贊皇、阜帥、酸棗，駿優(yōu)的cAMP 是酸棗的35.26 倍；cGMP含量由高到低依次為駿優(yōu)、駿棗、灰棗、梨棗、伏脆蜜、冬棗、大白鈴、贊皇、酸棗、阜帥，駿優(yōu)的cGMP 是阜帥的113.72 倍；同一品種的cAMP 均高于cGMP 含量，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相似。

3 結(jié)論

通過對(duì)流動(dòng)相與水相比例的優(yōu)化，建立了同時(shí)測(cè)定棗果中cAMP 和cGMP 的HPLC 方法，該方法具有流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、色譜峰分離度好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。通過對(duì)10 個(gè)紅棗品種的分析，發(fā)現(xiàn)同一品種棗果中cAMP 含量均大于cGMP，不同品種間二者含量差異顯著（p<0.05）。駿優(yōu)、駿棗和灰棗的cAMP 和cGMP 含量較高，其中駿棗和灰棗是新疆主栽品種[16]，而駿優(yōu)是從駿棗芽變材料選育出的一個(gè)優(yōu)良品種，這3 個(gè)品種都屬于干制品種，說(shuō)明cAMP 和cGMP 是新疆干制紅棗中重要的活性成分，可作為新疆干制紅棗品質(zhì)的質(zhì)量指標(biāo)。