楊樹抗寒分子機理研究策略

楊成超

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 營口 115213)

溫度是決定植物地域分布的主要限制因子，全世界每年因低溫對植物造成的經濟損失達數十億元。楊樹是多年生木本植物，較早完成基因組測序，是開展抗寒分子機理研究的模式樹木，是耐凍融分子機制研究的理想材料。楊樹凍融傷害分為可逆凍融傷害和不可逆凍融傷害，有效凍融傷害的累積效應是楊樹越冬死亡的主要原因[1，2]。楊樹具有在可逆凍融傷害后自我修復的能力是其最終能從冬季嚴寒中存活下來的關鍵，楊樹抗寒分子機理研究對楊樹抗寒育種具有重要意義。

楊樹響應低溫脅迫分為幾個階段：信號感知(signal perception)、信號轉導(transduction)、次級信號(Secondary signals)和靶基因響應(target-responses)等。近20年來，樹樹抗寒機理研究進展緩慢，主流觀點是20世紀的細胞膜結構和功能傷害及活性氧導致的氧化性損傷。一般認為，細胞膜最先感知到環境溫度變化，將信號傳遞到胞內。此外，組蛋白激酶、鈣離子通道及磷脂酶等都可能扮演著次級溫度感受器的角色。研究人員長期專注于抗凍鍛煉階段冷脅迫和零下輕度凍脅迫的冷信號感知及冷信號傳導機制研究，例如Chen J等[3]對4 ℃和-4 ℃處理的胡楊(Populuseuphratica)葉片的轉錄組研究和Yang X Y 等[4]對4 ℃處理的毛白楊(P.tomentosa)葉片的轉錄組研究，而對較低溫度(如-40 ℃)凍脅迫階段的研究未見報道。

1 楊樹細胞外和細胞內冰點精確測定

楊樹凍害指冰點以下低溫造成的傷害。冰點分為胞外冰點和胞內冰點。研究表明，胞外冰點可能造成細胞損傷，但一般不致死，而胞內結冰會造成細胞死亡。另外，有效凍融傷害的累積超過抗凍融度，也會造成組織死亡[1]。因此，要研究楊樹可逆凍融傷害修復，首先要精確測定胞外冰點和胞內冰點溫度，然后是有效凍融傷害的閾值[2]。

當前的楊樹抗寒評價技術主要是測定相對電導率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖等生理指標。根據相對電導率確定的半致死溫度不是細胞冰點，現在缺乏可精確測定細胞冰點的新技術來確定楊樹在抗寒鍛煉期、深度休眠期和脫鍛煉期胞外和胞內冰點。該項技術研究將為楊樹抗寒性精確評價和凍融傷害修復分子機理研究奠定基礎。

2 凍融傷害修復與膜再密封

洋蔥表皮蛋白質組學[5]和菠菜葉靶標蛋白研究[6]是已開展的2個與凍融修復相關的典型研究。組織的凍融傷害修復程度通過融化后離子滲出率的減少、光合系統Ⅱ的光合效率恢復、抗氧化酶激活或者活性氧的損耗來評估。組織化學染色表明，在菠菜葉凍融傷害修復期間受傷害組織活性氧的累積或它們被減少的強度同損耗修復一致。

蛋白和基因的豐度直接或間接與膜聯蛋白離子平衡相關，受傷害組織的橫跨膜水通道蛋白減少，但在融化后修復。修復期間，K+流或離子平衡可能被14-3-3蛋白和膜聯蛋白控制，細胞膜中驅動橫跨膜K+運輸的H+-ATPase是14-3-3對細胞膜整合和激活的主要目標[7]。也就是說，14-3-3蛋白能激活向內的K+通道[8]。通過離子平衡和氧化脅迫的改善，鈣磷脂結合蛋白能夠促進凍融傷害修復，值得研究。

膜再密封策略在膜凍融傷害修復過程中是可行的。在植物細胞背景下，凍害誘導的囊泡已被用親脂的熒光染料和共聚焦低溫顯微鏡觀察到。Ca2+通過細胞膜上的穿孔點從細胞外間隙流入，最終導致冰凍誘導的囊泡經由Ca2+綁定突觸結合蛋白進行融合和細胞膜傷害點的再密封。這表明細胞外Ca2+提高原生質體或未損傷葉細胞的耐凍性和抗電穿孔能力是膜保護而不是膜穿孔的象征[9]。當前，楊樹還沒有開展凍融傷害后的質膜修復分子機理研究。

3 CBF/DREB調節

在林木抗寒性調控及響應機制方面，發現了CBF/DREB低溫信號調節途徑及相關轉錄子。其中，在楊樹[10]、藍桉(Eucalyptusglobulus)[11]、葡萄(Vitisvinifera)[12]等分離鑒定出CBF直系同源基因。CBF/DREB系統誘導抗寒基因表達所編碼的防凍蛋白，對保護植物細胞免于低溫脅迫傷害很重要。例如，楊樹CBF調節因子CBF1、CBF2和CBF3表達誘導物ICEl在冬季休眠芽中上調了391倍，抗寒性增強。

4 轉錄調控

轉錄組可定量分析生物受外界環境影響的各基因表達的變化，主要檢測的是生物體RNA水平的基因表達量。Chen 等[3]將2年生胡楊分別置于4 ℃和-4 ℃處理6 h后，使用Solexa測序技術對其葉片做轉錄物組測序。Wang等[13]鑒定了茶樹(Camelliasinensis)在自然越冬條件下抗凍鍛煉后差異表達基因，包括低溫應答基因、質膜穩定基因、滲透應答基因等。上述研究表明，抗凍性強的胡楊關鍵轉錄成分主要與ABA及鈣信號傳導相關，而在抗凍性較弱的茶樹中碳水化合物代謝途徑和鈣信號通路相關基因起主要作用。

小RNAs通過降解mRNA、抑制翻譯和修飾染色質誘導轉錄后基因沉默，在植物脅迫響應過程中發揮著重要作用[14]。Lu等[15]通過構建楊樹脅迫處理前后的小RNA文庫，成功鑒定19個冷響應miRNAs，其中miR397等低溫上調，miR156g-j等低溫下調。Chen等[16]也在楊樹中鑒定了脅迫響應相關的miRNAs。但目前有關小RNAs調控基因表達及產生抗逆性的具體分子調控機制還不明確，須進一步研究。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長度大于200個核苷酸、不具備蛋白編碼功能的RNA。應用深度測序和生物信息學分析，在擬南芥、水稻、番茄等中鑒定了數千種lncRNAs[17]。在lncRNA響應低溫脅迫功能研究方面，模式植物擬南芥取得進展，在其基因組的低溫敏感區域鑒定了一個叫SVALKA的lncRNA，SVALKA的突變會影響CBF1基因的表達和植物的冷害抗性[18]。但大多數lncRNA的生物學功能還不清楚。在楊樹方面，主要研究了lncRNA在毛白楊木材形成[19]中的作用、lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網絡調節楊樹根和莖頂端分生組織的發育[20]、IAA響應的毛白楊lncRNA基因甲基化和生長發育[21]、小葉楊非編碼RNA甲基化調節非生物脅迫基因表達[22]。lncRNA調控楊樹凍融傷害方面未見報道。

5 CRISPR/Cas9技術

CRISPR/Cas9技術是基于細菌體內的獲得性免疫機制改造而成，可通過一條單鏈的單向導RNA(sgRNA)來識別特定DNA序列，并引導Cas9核酸內切酶剪切DNA雙鏈[23]。該技術已被廣泛應用于細菌、酵母和動物的基因組編輯中[24]，而且，李然等利用CRISPR/Cas9技術對番茄lncRNA1459進行了編輯，獲得了lncRNA1459的功能缺失突變體[25]。這說明，CRISPR/Cas9技術可以用于lncRNA基因功能研究。

CRISPR/Cas9系統具備同時快速高效地敲除多個內源基因的優勢。利用改良的CRISPR/Cas9多靶點載體系統[26]，在楊樹體內同時表達Cas9蛋白和多個針對八氫番茄紅素脫氫酶基因的sgRNA，在楊樹體內實現了對內源基因的高效定點敲除，獲得穩定的基因定點敲除的突變體株系[27]。CRISPR/Cas9系統在楊樹功能基因研究和遺傳改良中具有廣泛的應用前景。

6 DNA修復

DNA修復是細胞對DNA受損傷后的一種反應，這種反應可能使DNA結構恢復原樣，重新執行它原來的功能，使細胞能繼續生存。如果細胞不具備這種修復功能，就無法應對經常發生的DNA損傷事件，就不能生存，所以研究DNA修復是探索生命的一個重要課題。David R. Liu發明了堿基編輯器，首先借助CRISPRi篩選發現多種促進C-G編輯的因子，在此基礎上構建出的新CGBEs的編輯效果有明顯提升[28]，使DNA人工修復成為可能。楊樹在抗寒性分子機理方面還沒有開展DNA修復研究。

7 問題與展望

在楊樹基因組測序完成的背景下，楊樹抗寒分子機理研究思路從單一基因或蛋白質轉向同時對多個基因或蛋白質功能的系統發掘。凍融傷害作為數量性狀，受到多基因、多水平的協同調控。研究楊樹凍融傷害修復的分子機理是抗寒分子機理研究的發展趨勢之一。楊樹凍融傷害修復過程中，哪些基因在起作用？其功能是什么? 各個基因之間如何互作？在可逆凍融傷害DNA修復過程中哪些堿基發生了改變和修正？需要系統研究。