骨痹消巴布劑中祖師麻甲素高效液相色譜法含量測(cè)定

敖 利* 宋 健

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

骨痹消巴布劑是由祖師麻、白芍、當(dāng)歸、伸筋草等十幾味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有活血通絡(luò)、散寒鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)肝強(qiáng)腎的功效，臨床上用于治療退行性骨關(guān)節(jié)病及其他關(guān)節(jié)類(lèi)疼痛病癥。骨痹消巴布劑是我院骨科醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)方制劑，從前制為熏洗液在臨床上應(yīng)用多年，對(duì)治療退行性骨關(guān)節(jié)病及其他關(guān)節(jié)類(lèi)疼痛病癥有很好的療效，但臨床運(yùn)用比較局限，患者使用攜帶不方便，因此將此制劑改進(jìn)為更方便，更新的劑型。本課題對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方劑型進(jìn)行改進(jìn)，主要進(jìn)行制劑工藝、質(zhì)量、體外釋藥評(píng)價(jià)、藥理等實(shí)驗(yàn)研究，研究治療骨關(guān)節(jié)病的經(jīng)皮給藥新劑型巴布劑，并對(duì)拓展中藥內(nèi)病外治思路、探索中醫(yī)藥特色治療適應(yīng)技術(shù)和中藥特色新制劑進(jìn)行有益嘗試。方中主藥祖師麻為瑞香科植物唐古特瑞香的莖皮和根皮，治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)炎等療效確切，其主要藥效成分為祖師麻甲素又稱(chēng)瑞香素（daphnetin，7，8-二羥基香豆素），瑞香苷（daphnin，7，8-二羥基香豆素-7-β-D-葡萄糖苷），皂苷等[1-5]。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，祖師麻甲素具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗凝、抗血栓等作用。為更好控制該制劑質(zhì)量，以祖師麻所含的主要有效成分之一祖師麻甲素含量為考察指標(biāo)，建立祖師麻甲素高效液相色譜含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)研究[6-11]。

1 材料與儀器

儀器與試藥：Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；MS-104S型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Thermo Genepuer UF超純水儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Eppendorf Research plus 移液器（德國(guó)艾本德公司）；AS10200A型數(shù)控超聲波清洗器（天津奧特芬恩斯儀器有限公司）；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；HH-S11-2-S型電熱恒溫水浴鍋（上海百典儀器設(shè)備有限公司）。對(duì)照品：祖師麻甲素（瑞香素）Daphnetin 10900-201607（中國(guó)食品藥品制定檢定院）；水（超純水）；甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純（Sigma公司）；骨痹消巴布劑（本課題組制備，20191016，20191017，20191018）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 試驗(yàn)色譜柱：Agilent ZORBAX TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸（20∶80）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器；樣品進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，祖師麻甲素與樣品中其他組分色譜峰可基線分離，陰性對(duì)照在祖師麻甲素色譜峰處無(wú)相應(yīng)峰出現(xiàn)；祖師麻甲素的保留時(shí)間為19.17 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 骨痹消巴布劑高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)定祖師麻甲素5.4 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻即得（每1 mL含祖師麻甲素54 μg）。

2.2.2 供試品溶液 取骨痹消巴布劑除去背襯，剪碎，混勻，取5.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理60 min（頻率40 kHz，功率250 W），濾過(guò)，轉(zhuǎn)至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取一定量置于5 mL離心管中，以4 000 r/min的速率離心5 min，用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)后直接進(jìn)樣。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例及制備工藝，配制不含祖師麻藥材的陰性樣品，再按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取祖師麻對(duì)照品溶液（濃度54 μg/mL），依次進(jìn)樣2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，記錄色譜圖。以祖師麻甲素的量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以進(jìn)樣質(zhì)量（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=4001.4 X+11.182，r=0.9997。結(jié)果表明，祖師麻甲素進(jìn)樣量在0.108～0.540 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取祖師麻甲素對(duì)照品溶液（0.027 mg/mL）10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定祖師麻甲素峰面積，其RSD=0.98%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法制備骨痹消巴布劑（批號(hào)20191018）供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h準(zhǔn)確吸取該溶液10 μL注入色譜儀，測(cè)定峰面積，其RSD=0.74%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)20191018），按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備5份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定祖師麻甲素的峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.80%，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知量的供試品2.5 g（祖師麻甲素含量0.238 mg/g），置具塞錐形瓶中，再分別精密加入一定量的祖師麻甲素對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取3批供試品，每批各取3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中祖師麻甲素含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

關(guān)節(jié)退行性骨關(guān)節(jié)病（osteoarthrosis，OA）是一種關(guān)節(jié)軟骨變性退化、骨質(zhì)增生為特征的，多種病因引起的關(guān)節(jié)退化、膝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織退變所致的慢性退行性關(guān)節(jié)病。目前尚無(wú)藥物可使骨性關(guān)節(jié)炎的病程逆轉(zhuǎn)和停止。OA患者的臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形、功能障礙，屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)骨痹的范疇，其發(fā)病機(jī)制為風(fēng)寒濕邪侵襲，阻閉經(jīng)絡(luò)，筋骨郁結(jié)，或勞損外傷，氣血瘀滯，或年老體虛，肝腎不足，骨痿筋馳，筋骨失養(yǎng)。臨床發(fā)病特征為女多于男，可能與女性絕經(jīng)后雌激素分泌下降有關(guān)。OA是骨科常見(jiàn)病、多發(fā)病，也是中老年人的常見(jiàn)病。隨著近年來(lái)人口老齡化趨勢(shì)的發(fā)展，其發(fā)病率也明顯升高，對(duì)人類(lèi)健康危害越來(lái)越大。我國(guó)現(xiàn)有65歲以上老年人已達(dá)1.5億，國(guó)內(nèi)調(diào)查該病發(fā)病率為3%～9%。其治療包括藥物內(nèi)外治療、功能鍛煉、理療、關(guān)節(jié)腔內(nèi)治療等。由于中老年人自身生理功能的衰退以及并發(fā)的其他臟器的疾病，往往限制了內(nèi)服藥的使用。

傳統(tǒng)中醫(yī)骨傷科所用的中草藥外用劑型為數(shù)不少，主要是水劑、酊劑、膏劑、散劑、油劑、搽劑、洗劑等，隨著藥物劑型的現(xiàn)代化研究，藥用高分子材料的發(fā)展，一種新型的外用藥物劑型——巴布劑因其方便臨床用藥并使藥物發(fā)揮最佳療效的優(yōu)點(diǎn)開(kāi)始引起藥劑研究人員的重視。巴布劑是將藥物、藥材提取物加入水溶性高分子材料基質(zhì)，經(jīng)煉和、涂布、剪切等工藝制成的一種載藥量大，透皮效果好的透皮吸收制劑。巴布劑使用方便，適宜治療不宜口服藥物或口服藥物無(wú)用的疾病，避免藥物在胃腸道的降解，減少藥物作用的個(gè)體差異，且一次用藥即可以長(zhǎng)時(shí)間恒定速率進(jìn)入體內(nèi)，有長(zhǎng)效，緩釋的優(yōu)點(diǎn)。巴布劑還有很多優(yōu)點(diǎn)：載藥量大，非常適合中藥多組分、大劑量的用藥特點(diǎn)；與皮膚相容性好，易透皮吸收，透氣性好，保濕性好，刺激性小，可反復(fù)敷貼，增加患者依從性；用藥安全，方便治療，劑量準(zhǔn)確，面積固定，血藥濃度平穩(wěn)；生產(chǎn)無(wú)有機(jī)溶媒污染，環(huán)保。因此，巴布劑是有很好發(fā)展前景的外用中藥新劑型。

外治法名著《理論駢文》明確指出“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥，每即內(nèi)治之藥。所異者，法耳。”并認(rèn)為“膏可統(tǒng)治百病”。骨痹消巴布劑是中藥經(jīng)皮給藥制劑，符合中醫(yī)“內(nèi)病外治”的理論，用于治療OA這種中老年人常見(jiàn)病慢性病，藥物可直接作用于穴位或患病部位，并通過(guò)滲透作用經(jīng)絡(luò)吸收，進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)臟腑病所，發(fā)揮藥物歸經(jīng)治療功效。本方經(jīng)臨床和藥理學(xué)初步驗(yàn)證，可通過(guò)降低炎性細(xì)胞因子水平對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起治療作用，減輕膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的病理?yè)p傷，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用。骨痹消巴布劑經(jīng)皮給藥可避免口服藥物對(duì)腸胃的刺激和肝臟的首過(guò)效應(yīng)，一次用藥可長(zhǎng)時(shí)間恒定速率進(jìn)入體內(nèi)，維持血藥濃度平穩(wěn)無(wú)峰谷現(xiàn)象，患者使用方便安全有效。本品是中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜且用藥劑量較大，巴布劑載藥量大，可容納中藥復(fù)方的極細(xì)藥粉，提取藥等，讓中藥多種成分共同發(fā)揮治療作用。因此將有中醫(yī)理論指導(dǎo)、療效好的中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方劑型改進(jìn)為新型的經(jīng)皮給藥中藥劑型，拓展中藥內(nèi)病外治思路、探索中醫(yī)藥特色治療適應(yīng)技術(shù)和中藥特色新制劑。

巴布劑制備工藝主要包括基質(zhì)成型和制劑成型。基質(zhì)主要有黏著劑：聚丙烯酸鈉、卡波姆、明膠、西黃耆膠、CMC-Na；填充劑：高嶺土、氧化鋅、微粉硅膠；保濕劑：甘油、丙二醇、聚乙二醇；滲透促進(jìn)劑：氮酮、桉葉油。制劑成型工藝的影響因素主要有：攪拌煉和速度時(shí)間、煉和溫度、添加順序。巴布劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)：有感官評(píng)價(jià)和儀器檢測(cè)評(píng)價(jià)，儀器檢測(cè)指標(biāo)有：藥物黏著性、賦型性、穩(wěn)定性、皮膚刺激性、藥物釋放度等。方中主藥祖師麻含有香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)、木脂素類(lèi)等有效成分，其中主要有效成分祖師麻甲素為羥基香豆素類(lèi)，易溶于甲醇、乙醇等[12-15]。供試品制備采用甲醇提取，比較了回流與超聲提取，選用甲醇超聲提取1 h，便捷快速。流動(dòng)相的選擇，比較了甲醇-0.5%醋酸，甲醇-0.5%磷酸，結(jié)果表明醋酸、磷酸均可抑制祖師麻甲素中酚羥基的解離，磷酸效果更好，峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，因此選用甲醇-0.5%磷酸（20∶80），祖師麻甲素色譜峰與雜質(zhì)峰基線分離，峰形好，保留時(shí)間適中。柱溫的選擇，比較了柱溫30 ℃、35 ℃、40 ℃的色譜圖，選用40 ℃柱溫，柱壓降低，出峰時(shí)間適中，分離度較好。

本文方法樣品處理簡(jiǎn)單，回收率好，快捷準(zhǔn)確，可作為骨痹消巴布劑質(zhì)量控制的依據(jù)和方法。