123熱水浸提—膜分離聯(lián)用提取板栗寡糖及其抗氧化活性研究

＊孟迪 史天星 薛金燕 梁力曼 牛奎

（河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院 河北 066004）

寡糖（低聚糖）因其具有抗氧化[1]、抗齲齒[2]、優(yōu)化腸道菌群[3]、增強(qiáng)免疫力[4]等多種潛在生理功能，已逐漸在營養(yǎng)保健食品的研發(fā)與生產(chǎn)中成為一類重要的功能性食品基料。由于天然存在的活性物質(zhì)往往具有更低的毒性、更高的穩(wěn)定性和更好的生物相容性，當(dāng)前，從自然界動植物和微生物中分離篩選功能性寡糖一直是天然產(chǎn)物領(lǐng)域研究的熱點之一。

板栗（Castanea mollissima）是我國的生態(tài)經(jīng)濟(jì)型樹種之一，其種仁是制作食療藥膳的上等原料，可有效預(yù)防和治療高血壓、冠心病、動脈硬化等心血管疾病[5-6]。目前，栗仁中營養(yǎng)活性成分的相關(guān)研究聚焦于板栗淀粉、蛋白質(zhì)及膳食纖維等，而針對其中寡糖成分的提取分離以及活性功能研究迄今尚未見報道。本文采用熱水浸提—膜分離聯(lián)用法分離栗仁可溶性總糖中的寡糖組分，經(jīng)陰離子柱層析純化得到中性寡糖。利用凝膠滲透色譜測試其分子量，分別借助紫外光譜和掃描電鏡研究其理化性質(zhì)，并對其抗氧化活性進(jìn)行了評價，為板栗寡糖的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

(1)材料與儀器

①原料與試劑

板栗采自青龍滿族自治縣，剝除外殼和內(nèi)皮后將栗仁置于60℃烘箱干燥過夜，再經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，板栗粉于-40℃低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，96%）、水楊酸（AR）購自上海麥克林生化科技有限公司；牛血清蛋白（98%）、考馬斯亮藍(lán)（AR）、咔唑（AR）、D-葡萄糖醛酸（98%）及其它試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

②儀器

高壓平板膜設(shè)備（FlowMem-0005-PN40，廈門福美科技有限公司）；冷凍干燥機(jī)（ALPHA 2-4 LD plus，德國Marin Christ公司）；激光光散射儀（DAWN HELEOS Ⅱ，美國Wyatt technology公司）；紫外可見分光光度計（UV-5500，上海元析儀器有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8010，日本Hitachi公司）。

(2)試驗方法

①板栗寡糖的提取純化

將50g板栗粉在80℃下熱水浸提2h，料液比為1:15。6000rpm下離心5min，濾渣重復(fù)浸提，合并兩次浸提液作為膜分離起始物料。浸提液首先進(jìn)行微濾（0.1μm膜，壓力10bar），所得滲透液繼續(xù)進(jìn)行超濾（3000Da膜，壓力10bar），最后將滲透液進(jìn)行納濾（300Da膜，壓力12bar）。取最終截留液減壓濃縮，冷凍干燥后得到粗寡糖COC。

稱取100mg COC溶于20mL超純水，超聲溶解至溶液澄清，溶液過0.45μm濾膜后于DEAE Sepharose FF瓊脂糖凝膠柱上樣洗脫。分別用超純水，0.1M、0.5M和1.0M NaCl溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，5mL/管收集洗脫液。以苯酚-硫酸法跟蹤檢測并繪制洗脫曲線。合并中性寡糖溶液，減壓濃縮后以MW300透析袋透析，冷凍干燥后得到中性寡糖NOC。

②理化性質(zhì)的測定

A.化學(xué)組成分析

分別采用苯酚硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法和咔唑硫酸法測定樣品的糖含量、蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量。

B.分子量測定

利用凝膠色譜-示差-多角度激光光散射（GPCRI-MALS）測定樣品分子量。取1mg樣品加1mL 0.1M NaNO3溶解，14000rpm離心10min，取100μm上清液上樣。分析柱：Ohpak SB-805 HQ，Ohpak SB-804 HQ，Ohpak SB-803 HQ；柱溫45℃，流動相0.1M NaNO3，流速0.4mL/min。

C.形貌觀察

將樣品粉末均勻涂覆在貼有雙面碳導(dǎo)電膠帶的進(jìn)樣臺上，真空噴金處理，加速電壓5.0kV下觀察寡糖微觀形貌。

③抗氧化活性測定

配制2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的樣品溶液，吸取50μL樣品溶液與150μL濃度為200μmol/L的DPPH乙醇溶液振蕩混勻，避光反應(yīng)30min后利用酶標(biāo)儀測試517nm處吸光度值，記為Ai。用乙醇分別代替樣品溶液和DPPH溶液，重復(fù)操作，測試517nm處吸光度值，分別記為A0和Aj。以相同濃度Vc溶液作為對照組，根據(jù)公式（1）計算DPPH自由基清除率。

2.結(jié)果與討論

(1)板栗寡糖的提取純化

實驗以50g板栗粉為初始原料，經(jīng)熱水提取和膜分離處理得到1.55g粗寡糖COC，得率為3.1%。圖1為COC在DEAE Sepharose FF層析柱上的洗脫曲線，COC先后以超純水和NaCl溶液洗脫都有明顯的洗脫峰，說明樣品COC中同時含有中、酸性糖組分。收集合并第10～25管中性洗脫液，經(jīng)透析、冷凍干燥后得到樣品NOC。表1中樣品的糖含量、蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量表明柱層析不僅可以除去粗寡糖中的糖醛酸，還能進(jìn)一步吸除蛋白和提升糖純度。樣品NOC的糖純度高于95%，且?guī)缀醪缓鞍踪|(zhì)和糖醛酸，為該寡糖后續(xù)理化性質(zhì)的測定和結(jié)構(gòu)表征奠定了基礎(chǔ)。

圖1 樣品COC在DEAE Sepharose FF陰離子交換柱上的洗脫曲線

表1 所提取板栗寡糖的糖含量、蛋白質(zhì)含量及糖醛酸含量

(2)板栗寡糖的理化性質(zhì)測定

借助GPC-RI-MALS測試樣品NOC的分子量，其分析如圖1所示。本實驗采用光散射技術(shù)和凝膠滲透色譜分離技術(shù)相結(jié)合的分子量測定方式，得到樣品的絕對分子量。表2給出了利用軟件ASTRA 6.1處理色譜數(shù)據(jù)得到的分子量信息，樣品NOC的分子量多分散系數(shù)低至1.054，分子量分布非常窄。由重均分子量Mw為670Da分析可知該寡糖是一種四糖結(jié)構(gòu)。

表2 NOC的分子量分析結(jié)果

圖2 GPC-RI-MALS測試樣品NOC的分子量分析圖

樣品COC和NOC在掃描電鏡下放大100倍觀察到的微觀形貌如圖3所示。COC呈大小形狀不一、分散性較好、表面光滑且有孔洞結(jié)構(gòu)的薄片狀形貌，而中性寡糖NOC則呈現(xiàn)樹枝狀或纖維狀的聚集形態(tài)。

圖3 粗寡糖COC（a）與中性寡糖NOC（b）的掃描電鏡圖片

(3)抗氧化活性研究

實驗采用DPPH法，以Vc為對照組對提取得到的寡糖NOC進(jìn)行抗氧化能力測定，結(jié)果見圖4。由圖可知，NOC溶液的DPPH自由基清除能力具有明顯的濃度效應(yīng)，在濃度為2mg/mL時對DPPH自由基的清除率為（31.47±0.47）%，濃度升高至10mg/mL時清除率升至（68.03±1.55）%，半數(shù)清除濃度EC50為5.01mg/mL。盡管與對照組Vc相比，寡糖NOC的抗氧化能力有一定差距，但相對其它已報道的寡糖展現(xiàn)了較高的DPPH自由基清除能力[7-8]，在低聚糖類物質(zhì)中顯示出較好的抗氧化活性。

圖4 不同濃度寡糖NOC以及對照組Vc對DPPH自由基的清除率

3.結(jié)論

本文采用熱水浸提—膜分離聯(lián)用的方法分離栗仁寡糖，經(jīng)陰離子柱層析純化得到中性寡糖。理化性質(zhì)測試表明該寡糖中幾乎不含蛋白質(zhì)和糖醛酸，糖純度高于95%，其顆粒微觀形貌呈現(xiàn)纖維狀聚集形態(tài)，是一種重均分子量為670Da的四元寡糖。寡糖NOC有著較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，EC50為5.01mg/mL，展現(xiàn)出較好的抗氧化活性。本研究首次從板栗種仁中提取純化得到了板栗寡糖，這對深入發(fā)掘板栗中營養(yǎng)功能成分以及板栗的高值化利用具有重要意義。