張家口、林芝、雅江口蘑的氣相色譜指紋圖譜

＊支國(guó) 韓博 武考濤 黃麗英 王春云 陳誼

（1.張家口學(xué)院 河北 075000 2.張家口市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 河北 075000）

食用菌通俗稱其為蘑菇。不同產(chǎn)地、不同品種中的各種食用菌中所含揮發(fā)性的主要成份種類與相對(duì)濃度也各稍有不同，因而每類化合物呈現(xiàn)不同的香氣特征[1]。

本文利用固相微萃取法分別提取產(chǎn)自張家口地區(qū)、林芝、雅江3處的口蘑子實(shí)體的揮發(fā)性物質(zhì)，并綜合運(yùn)用了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），對(duì)我國(guó)3種來(lái)自不同原料產(chǎn)地的口蘑提取物的主要揮發(fā)性成份分別進(jìn)行了全面細(xì)致深入的成分剖析研究與成分對(duì)比，快速直觀的辨別口蘑的產(chǎn)地和種類，為口蘑的品質(zhì)評(píng)定及與其他種類的區(qū)分鑒定打下基礎(chǔ)[2]，為更好地綜合利用3種不同產(chǎn)地的口蘑資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)[3-5]。

1.儀器與試劑

（1）儀器。賽默飛單四級(jí)桿質(zhì)譜：TSQ9000；氣相色譜儀：Trace 1310；自動(dòng)進(jìn)樣器：TriPlus RSH，SPME模塊；軟件：Chromeleon和Deconvolution插件；微量進(jìn)樣器；電子天平。

（2）試劑。乙醚；丙酮；口蘑。

2.方法

（1）實(shí)驗(yàn)條件。固相微萃取（SPME）條件：SPME萃取頭為PDMS；萃取頭老化：在GC進(jìn)樣口老化20min；樣品孵化：65℃，15min，振蕩；SPME萃取：65℃，30min，萃取頭插入瓶中20mm；SPME進(jìn)樣：在GC進(jìn)樣口解吸2min。

色譜（GC）條件：色譜柱為T(mén)G-5SIL MS（30m×0.25mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為He，1.2mL/min；程序升溫（初溫45℃，保持2min，以4℃/min升到150℃，以10℃/min升到260℃，保持5min）；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比10:1。

質(zhì)譜（MS）條件：電離條件為EI，70eV；傳輸線溫度為270℃；離子源溫度為300℃；掃描范圍為33～450m/z。

（2）口蘑樣品的預(yù)處理。3個(gè)待測(cè)樣品制備方法：分別取樣品，將干制口蘑1cm×1cm×1cm的均勻小塊，稱取1g左右的干制口蘑樣品于20mL頂空瓶。

空白：取一個(gè)干凈的固相微萃取瓶作為空白。

保留指數(shù)標(biāo)液：取一個(gè)干凈的固相微萃取瓶，加入一定量的正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.結(jié)果與討論

（1）不同產(chǎn)地口蘑子實(shí)體中揮發(fā)性成分的GC-MS分析。采用有機(jī)溶劑萃取-蒸餾法提取張家口地區(qū)、林芝、雅江3處的口蘑子實(shí)體的揮發(fā)性物質(zhì)，并應(yīng)用GC-MS技術(shù)分析其化學(xué)成分，獲得GC-MS總離子圖譜（圖3）。對(duì)口蘑樣品的全掃描TIC圖進(jìn)行NIST譜庫(kù)自動(dòng)檢索，采用面積歸一化法定量，通過(guò)比較含量高低可以粗略篩選主要香氣成分。對(duì)全掃描TIC圖進(jìn)行解卷積處理。

取樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，分別測(cè)試了空白、口蘑樣品、保留指數(shù)標(biāo)液，分別做10次張家口樣、林芝樣、雅江樣口蘑的平行樣品，記錄色譜圖。空白檢出了6個(gè)明顯的峰，經(jīng)NIST譜庫(kù)檢索，均為柱流失峰。將口蘑樣品與空白樣品對(duì)比，確認(rèn)樣品中的柱流失峰，其總離子流程圖（TIC）（圖1）。通過(guò)保留指數(shù)標(biāo)液，獲得從正辛烷到正二十一烷的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間（圖2），結(jié)合保留指數(shù)為樣品中的揮發(fā)性成分輔助定性。

圖1 張家口口蘑樣品和空白的TIC圖

圖2 正構(gòu)烷烴的TIC圖

圖3 PLS-DA VIP值

（2）解卷積處理。對(duì)3種不同產(chǎn)地的口蘑樣品進(jìn)行解卷積數(shù)據(jù)處理。在3.6～36.4內(nèi)，以1e6為最小識(shí)別TIC強(qiáng)度，反匹配閾值為700的篩選條件下，在NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并用賽默飛Deconvolution插件對(duì)將實(shí)際樣品得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行解卷積處理，共識(shí)別出319個(gè)未知峰，每個(gè)峰都有對(duì)應(yīng)的峰識(shí)別列表，列出了譜庫(kù)中檢索出的候選化合物，按照命中率從高到低排列。

然后，對(duì)每個(gè)峰進(jìn)行篩查，去除掉明顯的非口蘑揮發(fā)性組分的物質(zhì)，再針對(duì)每個(gè)峰的候選列表進(jìn)行篩查，主要考察ΔRI值，選出綜合得分最高物質(zhì)，最后生成報(bào)告。

（3）化合物的鑒定。將得到的物質(zhì)按照峰面積歸一化法[6]，算出每個(gè)峰所占的百分比。我們選出峰面積大于1%的物質(zhì)如表1，并采用PLS-DA取VIP值大于1的成分作為標(biāo)志物（圖3）。

表1 口蘑揮發(fā)性組分主要成分

然而事實(shí)上，口蘑的香氣組分的閾值并不是相同的，并且具有很大差異。有一些對(duì)香氣貢獻(xiàn)很大的組分，常常是香氣閾值很低，結(jié)合得到的揮發(fā)性成分總組分表和有文獻(xiàn)報(bào)道[7]出松口蘑中的香氣成分組成，根據(jù)香氣研究的經(jīng)驗(yàn)，篩選判斷主要香氣成分。

4.討論

根據(jù)張家口、林芝和雅江樣品的干品揮發(fā)性香氣種類分析比較，可以看出醇類化合物在張家口樣和林芝樣中相對(duì)含量最多；酮類化合物僅在張家口樣中相對(duì)含量較多；醛類物質(zhì)在雅江樣中的相對(duì)含量遠(yuǎn)高于其他兩種，酚類化合物在張家口樣中的相對(duì)含量遠(yuǎn)高于其他兩種，酯類化合物在林芝樣和雅江樣中的相對(duì)含量基本一致，且遠(yuǎn)高于張家口樣；烷烴類化合物在張家口樣和雅江樣中的相對(duì)含量基本一致，且遠(yuǎn)高于林芝樣；酸類化合物在三者中的相對(duì)含量基本一致[8]。可見(jiàn)在不同產(chǎn)地的口蘑揮發(fā)性成分中，各類化合物所占比重不同，主要成分也隨產(chǎn)地的不同而不同。

由表1可見(jiàn)，在張家口樣鑒定出的8種主要揮發(fā)性化合物，酮類在總色譜流出峰面積中所占的相對(duì)百分含量最高，為7.46%；其他種類的化合物相對(duì)含量由高到低依次是酸類（5.95%）、烷烴（4.65%）、醇類（2.54%）、酯類（1.98%）、醛類（1.89%），共計(jì)24.47%；其中主要成分為2-吡咯烷酮（7.46%），其獨(dú)有且相對(duì)含量較高的化合物包括己酸（5.95%）。

在林芝樣鑒定出的11種主要揮發(fā)性化合物中，酯類在總色譜流出峰面積中所占的相對(duì)百分含量最高，為39.05%；其他種類的化合物相對(duì)含量由高到低依次為不飽和脂肪醇類（37.17%）、醛類（1.21%），共計(jì)77.43%；主要成分為1-辛烯-3-醇（28.43%），其中獨(dú)有且相對(duì)含量較高的化合物包括鄰苯二甲酸二丁酯（4.46%）、鄰苯二甲酸二異辛酯（3.22%）和油醇（2.23%）[8]。

在雅江樣鑒定出的8種主要揮發(fā)性化合物中，醛類在總色譜流出峰面積中所占的相對(duì)含量最高，為30.11%；其他4種類型中的揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)平均濃度含量由高到低依次為酯類（28.60%）、酸類（10.18%），共計(jì)64.45%；其主要成分為亞油酸甲酯（16.58%）和2-乙基己醛（16.54%）。其中獨(dú)有且相對(duì)含量較高的化合物主要包括癸酸異丙酯（10.03%）、7-甲氧基-3,7-二甲基辛醛（7.71%）和次大風(fēng)子酸（6.30%）[8]。

由此，我們可知，3處口蘑樣品的揮發(fā)性成分各有特點(diǎn)。其中張家口口蘑與林芝口蘑的揮發(fā)性成分具有一定的相似性，而張家口口蘑與雅江口蘑的揮發(fā)性成分的有較大差異。在張家口樣和林芝樣中，主要共有組分為1-辛烯-3-醇。在林芝樣和雅江樣中，主要共有組分為亞油酸甲酯。

縱觀近年來(lái)關(guān)于蘑菇中天然揮發(fā)性化合物的研究進(jìn)展及詳情[9]，食藥用類真菌子實(shí)體中的香味成分主要由其中一個(gè)品種或至少數(shù)個(gè)品種具有的較高的芳香值中的某些關(guān)鍵的揮發(fā)性物質(zhì)所構(gòu)成起來(lái)的，能夠充分體現(xiàn)其成熟的果實(shí)特有的一種香氣，對(duì)子實(shí)體產(chǎn)品的香氣風(fēng)味、質(zhì)量的比較優(yōu)劣和其真假的鑒定都起著關(guān)鍵性影響。因此根據(jù)不同產(chǎn)地的口蘑所特有的峰面積以及特有揮發(fā)性成分，就可以快速地鑒別出不同產(chǎn)地、不同種類的口蘑，為口蘑的初步鑒別和篩選提供了簡(jiǎn)單又便捷的方法。

5.討論

口蘑因其產(chǎn)地不同，品種又龐雜，所以很多時(shí)候不易辨別，根據(jù)口蘑特征香氣成分的快速對(duì)比和分析的結(jié)果，能夠在短期內(nèi)很好地進(jìn)行對(duì)張家口地區(qū)野生口蘑真菌的快速分類鑒定，這將對(duì)國(guó)家保護(hù)瀕危地理標(biāo)記產(chǎn)品保護(hù)以及加強(qiáng)對(duì)整個(gè)張家口地區(qū)野生食品真菌市場(chǎng)管理的進(jìn)一步規(guī)范有著十分重大深遠(yuǎn)的意義。