基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討桃紅四物湯治療膝骨關節(jié)炎的作用機制

趙士清 郭 青 葉 超 劉 越

（1 北京語言大學醫(yī)院，北京 100083；2 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院骨二科，北京 100700；3 北京市豐臺中西醫(yī)結合醫(yī)院，北京 100072）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關節(jié)軟骨發(fā)生破壞伴隨周圍骨贅形成，以膝周疼痛、關節(jié)活動受限為主的慢性退行性疾病，屬中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇[1-2]。目前非甾體抗炎類作為KOA的主要治療藥物，主要在于緩解疼痛等癥狀，但并不能有效延緩疾病的發(fā)展，且存在消化道、腎、心血管等不良反應風險[3]。在KOA中醫(yī)診療指南（2020年版）[2]指出，除對于有手術指征需進行手術治療外，其余均推薦首選中西醫(yī)結合療法或單獨應用中醫(yī)療法，由此可見中醫(yī)藥在KOA的治療中占據(jù)重要地位。桃紅四物湯始見于《醫(yī)宗金鑒》，全方由桃仁、紅花、當歸、川芎、熟地黃及芍藥組成，該方以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血、行氣之功，使瘀血祛、新血生、氣機暢。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明桃紅四物湯具有擴張血管、抗炎、調節(jié)免疫等功能[4-5]。相關臨床研究也顯示該方治療早期KOA的疼痛、關節(jié)活動障礙方面顯示出積極的療效[6-7]。但相關作用機制尚不十分明確。本研究應用網(wǎng)絡藥理學相關方法探析桃紅四物湯治療KOA的藥理機制，為臨床應用桃紅四物湯治療KOA提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分和潛在靶點 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），收集桃仁、紅花、當歸、川芎、熟地黃、白芍的化學成分，構建數(shù)據(jù)庫，利用生物利用度(OB≥30%) 和類藥性指數(shù)（DL≥0.18）篩選，選擇不同藥物的主要活性成分及潛在靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉換為人類相應標準基因，以作為桃紅四物湯活性成分基因靶點，隨后將所得數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1軟件構建“中藥-化合物-靶點”網(wǎng)絡圖。

1.2 疾病靶點篩選 以“knee osteoarthritis”或“osteoarthritis of the knee”為檢索詞分別根據(jù)數(shù)據(jù)庫特性檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，重復基因靶點保留1個，最終確定KOA疾病靶點。

1.3 藥物靶點與疾病相關基因集的Venn分析 將桃紅四物湯化學有效成分的基因靶點與KOA相關基因集進行Venn分析，二者共有基因即為桃紅四物湯治療KOA的潛在作用靶點。

1.4 構建蛋白質相互作用關系網(wǎng)絡（Protein-protein interaction network，PPI）將1.3得到的交集靶點導入STRING11.0平臺，獲得相關信息后，通過Cytoscape 3.9.1的cytoHubba工具構建蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖，分析各靶點之間的作用關系，并通過優(yōu)化與拓撲分析后選取平均值同時在度值分布（degree）、介度中心度（betweenness centrality）和接近中心度（closeness centrality）以上的靶點作為關鍵核心靶點。

1.5 GO及KEGG通路富集分析 Metascape 數(shù)據(jù)庫導入交集靶點，選擇物種為homo sapiens，獲取具有顯著性的富集信息（P＜0.01），基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析結果選取P值最小的10條，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）選取P值最小的20條，再應用在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）分別進行GO及KEGG富集氣泡圖繪制。

1.6 分子對接 將1.3中degree值前3活性成分作為配體、1.4中degree前3靶蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫中獲取靶蛋白3D結構，用Pymol 2.4.1進行預處理。Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的sdf結構，通過Chem3D軟件轉換成mol2文件。通過Autodock Tools 1.5.6軟件將受體和配體分別進行處理，AutoDock Vina計算結合能，最終通過Pymol可視化數(shù)據(jù)。分子對接結果的平均結合能若低于-5 kcal/mol表明靶點蛋白和化合物具有較好的結合活性。

2 結果

2.1 藥物主要活性成分和潛在靶點 桃紅四物湯中熟地黃（2）、白芍（13）、當歸（2）、川芎（7）、桃仁（23）、紅花（22）藥物有效成分69個，將篩重后44個有效成分編碼ID。見表1。通過UniProt 轉化得到的標準基因靶點代碼（Gene Symbol），篩重后得到潛在靶點218個，構建“中藥-化合物-靶點”網(wǎng)絡，見圖1。

圖1 桃紅四物湯中藥—化合物—靶點網(wǎng)絡圖

表1 桃紅四物湯主要活性成分信息

2.2 構建膝骨關節(jié)炎疾病相關基因集 檢索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫分別得到2 331、38、73、368個相關靶點基因，獲得疾病相關靶點2 810個，篩重后共得到2 486個KOA相關靶點基因，構成KOA疾病相關基因集。

2.3 藥物靶點與疾病相關基因集的Venn圖建立 Venn分析后得到桃紅四物湯與KOA共同靶點133個靶點，見圖2。

圖2 桃紅四物湯活性成分靶點和KOA靶點Venn圖

2.4 蛋白質相互作用關系網(wǎng)絡的構建 將133個交集靶點上傳STRING11.0平臺獲取蛋白之間的作用關系，通過Cytoscape3.9.1的cytoHubba工具構建蛋白質互作網(wǎng)絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）（圖3）。

圖3 桃紅四物湯治療KOA蛋白互作網(wǎng)絡圖

2.5 核心靶點的篩選 拓撲分析后其平均度值為89.11，介度中心度均值為0.0054，近中心度均值約為0.599，篩選后得到10個靶點。見表2。排名前3的分別為TNF、IL-6、AKT1。構建“化合物—核心靶點”圖，見圖4。得到排名前三位的核心成分為MOL000098、MOL000422、MOL000006，即槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和木犀草素（Luteolin）。

圖4 桃紅四物湯治療膝骨關節(jié)炎“化合物—核心靶點”圖

表2 桃紅四物湯治療膝骨關節(jié)炎核心靶點

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析 GO富集分析獲得生物過程（BP）5 220條、細胞組成（CC）和分子功能（MF）分別為458和691條，共6 369條。選取每部分排名前10且P＜0.01的建立氣泡圖（圖5）。KEGG通路富集分析共得到254條信號通路，篩選排名前20條通路建立氣泡圖（圖6）。

圖5 桃紅四物湯治療膝骨關節(jié)炎的GO富集分析。BP：生物過程；CC：細胞組分；MF：分子功能

圖6 桃紅四物湯治療膝骨關節(jié)炎的KEGG富集分析

2.7 分子對接驗證 關鍵活性成分與靶點的分子對接結果見表3，所有結合能均＜-5 kcal/mol，表明關鍵活性成分與靶蛋白之間具有較強的結合能力。以每一靶點與關鍵活性成分結合能最低的蛋白結構對接模式為例，進一步說明每一靶點能穩(wěn)定地對接到關節(jié)活性成分蛋白結構活性口袋中，說明關鍵活性成分與靶點具有良好的活性（圖7）。

表3 分子對接結果

圖7 關鍵靶點和活性成分結合模式分析。A：quercetin與TNF；B：Luteolin與IL-6；C:Luteolin與AKT1

3 討論

人口老齡化現(xiàn)象加重、飲食結構改變所導致的肥胖人群增多，KOA發(fā)病率逐年提高[8-10]。相關流行病學研究報道，60歲以上人群發(fā)病率超過50%[11-12]。盡管KOA的診斷和治療有了很大的發(fā)展，西醫(yī)早期主要以緩解癥狀為主，但并不能有效延緩疾病的發(fā)展，直到晚期仍需行人工膝關節(jié)置換，無論是經(jīng)濟還是心理上，對患者都造成了巨大負擔和壓力，且在此期間患者生活質量也大大降低[13-14]。KOA發(fā)生發(fā)展是一個復雜的病理過程，涉及多種物質，受多種途徑調節(jié)[15-16]。中藥復方具有多靶點、多途徑的生物學效應。作為一種傳統(tǒng)經(jīng)典復方，桃紅四物湯在臨床上被廣泛使用于治療骨折、軟組織損傷、骨關節(jié)炎等疾病，具有良好的療效[4,7,17]。該方以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血、行氣。方中以破血之品桃仁、紅花為主，力主活血化瘀；以甘溫之熟地、當歸滋陰補肝、養(yǎng)血調經(jīng)；芍藥養(yǎng)血和營，以增補血之力；川芎活血行氣、調暢氣血，以助活血之功。許季等[18]研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能夠有效緩解疼痛和關節(jié)僵硬等癥狀，同時能改善關節(jié)功能，優(yōu)化骨代謝指標水平，在治療KOA方面具有很高的潛在價值，但其作用機制不明。在本研究中，基于網(wǎng)絡藥理學，我們篩選了桃紅四物湯治療KOA的關鍵核心靶點和有效成分，并進行了PPI、GO和KEGG富集分析，明確了相關可能作用機制及通路，同時利用分子對接分析靶點蛋白和化合物的結合活性，為臨床應用桃紅四物湯治療KOA提供科學證據(jù)。

炎癥是KOA發(fā)生發(fā)展的一個重要因素[19]。促炎介質會誘導軟骨細胞的凋亡和細胞外基質的降解，同時由于調亡及降解的產(chǎn)物進一步誘發(fā)炎癥物質的產(chǎn)生，加重KOA病變程度[14]。本研究通過優(yōu)化與拓撲分析后選取平均值同時在degree、betweenness centrality和closeness centrality以上的靶點作為關鍵核心靶點，篩選出10個關鍵核心靶點，排名前3的分別為TNF、IL-6、AKT1。TNF作為一種常見的促炎介質，受體包括TNFR1和TNFR2兩種類型，均在軟骨細胞和滑膜細胞中表達[20]。TNF與受體結合后，激活下游的NF-κB信號通路，從而上調炎性介質表達，誘導炎性反應的發(fā)生[21]。IL-6作為一種促炎因子，往往和TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用，導致軟骨下骨發(fā)生變化，引起炎性反應和軟骨破壞[22]。此外，IL-6還可激活滑膜細胞和軟骨細胞中的MAPK信號通路，啟動信號級聯(lián)反應，導致關節(jié)軟骨的損傷[23]。研究表明，TNF、IL-6等炎性介質的不斷積累導致細胞外基質的降解，同時促進軟骨細胞凋亡[24-25]。而軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解是KOA進展中嚴重的病理變化[26]。這進一步說明炎性介質表達與KOA嚴重程度密切相關。AKT1作為PI3K/ATK信號通路中的重要調控因子，在調節(jié)細胞凋亡，減輕炎性反應，改善軟骨退變等方面發(fā)揮著重要作用[27]。秦燕等[28]研究發(fā)現(xiàn)OA軟骨細胞內存在AKT1明顯下調現(xiàn)象。以上說明桃紅四物湯治療KOA與調節(jié)TNF、IL-6、AKT1的表達密切相關。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、木犀草素是桃紅四物湯治療KOA的關鍵活性成分。槲皮素作為一種黃酮醇類化合物，可通過降低TNF、IL-6等炎性因子的表達水平達到抑制炎性反應以保護關節(jié)軟骨的目的[29]。山柰酚具有抗炎活性，通過調控細胞極化過程，減少炎性反應，抑制滑膜炎癥，保護關節(jié)軟骨，達到延緩KOA發(fā)展的目的[30]。NF-κB和MAPK通路是OA發(fā)展中與炎性反應相關的關鍵信號轉導通路，在促炎因子的誘導下，NF-κB發(fā)生活化和核易位中，從而導致炎性介質的表達，MAPKs則在軟骨發(fā)生中起著至關重要的作用[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素可降低IL-1β、TNF等炎性因子表達水平，發(fā)揮軟骨保護作用[33]。以上3種主要活性成分相輔相成，共同在KOA的發(fā)展過程中發(fā)揮抗炎、保護軟骨的作用，桃紅四物湯方治療KOA的療效提供有效證據(jù)。

GO通路富集分析顯示桃紅四物湯作用于KOA的發(fā)展過程中，主要涉及炎性反應、細胞凋亡、轉錄因子反應等生物學過程，提示桃紅四物湯治療KOA可能與抑制炎性反應，調控細胞凋亡相關。KEGG通路富集分析主要涉及TNF信號通路、IL-17信號通路及PI3K/Atk信號通路。IL-17的異常表達與OA的發(fā)病及疼痛程度密切相關，阻斷 IL-17信號傳導途徑可能會緩解 KOA 相關的疼痛[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17信號通路在桃紅四物湯治療后顯著富集，提示該分子通路可能是桃紅四物湯緩解KOA疼痛的主要分子途徑。TNF屬于促炎細胞因子，可激活IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子，還可激活MMP3、MMP9、MMP13等MMP類基因，調節(jié)關節(jié)局部炎性反應及軟骨組織重塑[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路顯著表達，提示桃紅四物湯不僅可以調控炎性反應，還可抑制關節(jié)軟骨的降解而發(fā)揮對KOA的治療作用。PI3K/Atk信號通路參與調節(jié)多種細胞增殖、凋亡及分化等過程[37]。樓紅侃等[38]研究發(fā)現(xiàn)該通路通過調節(jié)軟骨細胞凋亡，發(fā)揮對軟骨的保護作用，此外，PI3K/Atk信號通路調節(jié)軟骨細胞自噬活性，在一定程度上有利于延緩OA的發(fā)展[39]。

綜上所述，桃紅四物湯中的槲皮素、山柰酚、木犀草素等有效成分通過TNF、IL-6等關鍵靶點通過TNF信號通路、IL-17信號通路及PI3K/Atk信號通路，發(fā)揮降低炎性反應、調控細胞凋亡等作用達到治療KOA的目的，同時借助分子對接技術驗證有效活性成分與關鍵靶點之間具有較強的結果活性，為今后研究桃紅四物湯治療KOA作用機制提供借鑒作用。但隨著技術的更新迭代，數(shù)據(jù)庫不斷更新，現(xiàn)有數(shù)據(jù)也隨之產(chǎn)生變化，相應研究結果仍需要動物實驗進行驗證。