伊班膦酸鈉注射液的過敏性、溶血性和刺激性比較試驗

顧蕾蕾 何若琦 張逸民

（江蘇省藥物安全性評價中心，江蘇 南京 211800）

雙膦酸鹽是一類人工合成的焦磷酸鹽類藥物，此類有機化合物由一個碳原子連接2個磷原子形成“P-C-P”結構，碳原子上的2個側鏈取代基（R1和R2）決定其藥物效應。R1常常是羥基、氯基、氫基或烷烴基等化學集團。伊班磷酸鈉是第3代雙膦酸鹽，R2取代基中具有雜環(huán)，稱為異環(huán)型含氮雙膦酸鹽[1]。伊班膦酸鈉可以有效地抑制破骨細胞活性并誘導破骨細胞凋亡從而用于腫瘤骨轉移疾病的治療[2]。本文通過主動過敏試驗，被動皮膚過敏試驗，體外溶血試驗和血管刺激性試驗來評價伊班膦酸鈉（南京恒生制藥有限公司）的過敏性，溶血性和刺激性，并與參比制劑伊班膦酸鈉（Roche Pharma（Schweiz）Ltd）比較。

1 材料與方法

1.1 受試物 伊班膦酸鈉注射液（南京恒生制藥有限公司，批號191205），伊班膦酸鈉注射液（Roche Pharma(Schweiz)Ltd，批號H1101H03）

1.2 實驗動物 豚鼠（Hartley，SPF級）70只，來源北京維通利華實驗動物技術有限公司，（合格證號1100112011017489、1100112011017490），雌雄各半。豚鼠46只，雌雄各半，來源南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場（合格證號202003586、202003587）。新西蘭兔11只，6雌5雄，南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場，（合格證號202001461）。飼養(yǎng)房間溫濕度控制范圍：溫度18～26 ℃；相對濕度40%～70%。換氣次數(shù)≥8次/h。工作照明＞200 Lux；動物照明15～20 Lux（照明時間12 h/d，6:00開燈～18:00關燈）。本研究中涉及內容經過本研究所倫理委員會批準。

1.3 儀器 9903WOW電子計重秤（上海英展機電企業(yè)有限公司），BS124S分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗設備有限公司），ALH-30電子秤（上海英展機電企業(yè)有限公司），DL-5低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠），ST4040自動染色機（Leica），RM2245半自動切片機（Leica），ASP200全自動真空脫水機（Leica），BMJ-1B生物組織包埋機（天津愛華），BX41光學顯微鏡（OLYMPUS）。

1.4 方法

1.4.1 全身主動過敏試驗方法 實驗用健康豚鼠36只（Hartley,SPF級），每組6只，雌雄各半，致敏給藥3次，隔日分別腹腔注射給予受試物高劑量和低劑量、對照品高劑量和低劑量、陽性對照組（雞蛋清白蛋白）和陰性對照組（0.9%氯化鈉注射液）。在末次注射后的第14 d和21 d各激發(fā)一半動物。所有激發(fā)的動物在激發(fā)注射到注射后約3 h詳細觀察并記錄過敏反應情況、癥狀的起止時間。致敏階段高劑量組采用臨床原液，劑量為1.67 mg/kg，低劑量組劑量為0.5 mg/kg，陰性對照組采用0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組采用5 mg/只雞蛋清白蛋白，給藥體積均為0.5 mL/只。激發(fā)階段每組劑量為致敏階段的2倍，給藥體積均為1.0 mL/只[3]。過敏反應癥狀見表1，全身致敏性評價標準見表2。

表1 過敏反應癥狀

表2 全身致敏性評價標準

1.4.2 被動皮膚過敏試驗方法 本實驗分為抗血清制備階段和皮內致敏激發(fā)階段共2個階段[3]。①階段1：抗血清制備階段。實驗用健康豚鼠24只（Hartley，SPF級），雌雄各半，分為6組，分別為對照品高劑量組和低劑量組、受試物高劑量組和低劑量組、陽性對照組和陰性對照組，每組4只，各組分別腹腔給予受試物和對照品高劑量（劑量為1.67 mg/kg），低劑量（劑量為0.5 mg/kg），0.9%氯化鈉注射液及雞蛋清白蛋白5 mg/只，給藥體積均為0.5 mL/只，隔日1次，共3次。末次致敏后14 d，心臟取血，3 000 r/min離心10 min，制備血清，每組動物血清合并，制成混合抗血清。②階段2：皮內致敏激發(fā)階段。實驗用健康豚鼠36只，雌雄各半，分為6組，分別為對照品高劑量組和低劑量組、受試物高劑量組和低劑量組、陽性對照組和陰性對照組，每組6只。皮內致敏時在脊柱左側選取1個點，右側選取2個點。取各組含IgE的抗血清，用0.9%氯化鈉注射液等倍稀釋抗血清至3個梯度，分別為原濃度的1/2、1/4、1/8，依次在上述各點皮內注射體積為0.1 mL/點的抗血清。24 h后，各組豚鼠靜脈注射與致敏相同劑量的抗原和0.5 mL的0.5%伊文思藍混合液進行激發(fā)。給藥約30 min后所有動物麻醉后處死。剪取動物背部皮膚以觀察藍斑，測量皮膚內層的藍斑直徑。藍斑直徑＞5 mm為陽性，過敏反應表示成出現(xiàn)陽性反應的最大稀釋倍數(shù)。

1.4.3 溶血試驗方法 取試管14支，受試物和對照品各7支，按下表依次加入2%的紅細胞混懸液和0.9%氯化鈉注射液，混勻后按下表加入不同量的藥液，第6、7分別為陰性、陽性對照管。在搖勻后，置37 ℃恒溫箱中。開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h，判斷溶液是否出現(xiàn)溶血。最后1 h觀察結束后對所有試管進行拍照，拍照后輕輕搖晃試管使之混懸，觀察是否有紅細胞凝聚發(fā)生[4]。

表3 溶血試驗加樣表

1.4.4 血管刺激性試驗 取10只新西蘭兔（6雌4雄），受試物組新西蘭兔（3雌2雄）、對照品組新西蘭兔（3雌2雄），采用自身對照。受試物組左耳給受試物，濃度為1 mg/mL，給藥容積為1 mL/kg，右耳給等量的0.9%氯化鈉注射液，對照品組左耳給對照品，濃度為1 mg/mL，給藥體積1 mL/kg，右耳給等量的0.9%氯化鈉注射液，給藥1次，觀察左右耳的刺激反應來考察伊班膦酸鈉注射液的血管刺激情況。首次給藥后及每次給藥前、給藥后詳細觀察給藥部位的刺激反應，末次給藥72 h后受試物組3只（2雌1雄）、對照品組3只（2雌1雄），麻醉后處死，剩余4只（2雌2雄）動物恢復期觀察14 d后處死。動物處死后進行常規(guī)取材，剖取包括進針部位及耳緣靜脈的整個耳組織固定于12%乙醛中，從耳尖到耳根取近、中、遠三段。最后脫水、包埋、染色和光鏡檢查。肉眼觀察血管注射部位和周圍組織的刺激性反應情況，刺激性癥狀如下：0表示無明顯刺激性、1表示紅斑、2表示水腫、3表示潰瘍；嚴重程度：+表示輕微、++表示明顯、+++表示嚴重。根據(jù)肉眼觀察結果與組織病理學檢查結果綜合判定動物的血管刺激性[3]。

2 結果

2.1 全身主動過敏試驗 本實驗陰性對照組動物在2次激發(fā)注射后均無過敏癥狀。陽性對照組動物在2次激發(fā)注射后均出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、死亡等過敏反應癥狀。受試物和對照品低劑量組、受試物和對照品高劑量組動物在2次激發(fā)注射后均無過敏反應癥狀。在本中心GLP實驗室條件下，受試物伊班膦酸鈉注射液（批號：191205）無過敏反應。對照品伊班膦酸鈉注射液（批號：H1101H03）無過敏反應，全身主動過敏反應為陰性。結果見表4～5。

表4 過敏反應匯總表

表5 各組個體過敏反應記錄表

2.2 被動皮膚過敏試驗 陽性對照組豚鼠背部皮膚1﹕8稀釋點藍色反應斑的直徑均值為15.7 mm，1﹕4稀釋點藍色反應斑的直徑均值為16.2 mm，在1﹕2稀釋點藍色反應斑的直徑均值為28.5 mm，受試物高、低劑量組和對照品高、低劑量組動物激發(fā)注射后，豚鼠背部皮膚未見藍色反應斑點。陰性對照組動物激發(fā)注射后，豚鼠背部皮膚未見藍色反應斑點。在本中心GLP實驗室條件下，受試物伊班膦酸鈉注射液（批號：191205）和對照品伊班膦酸鈉注射液（批號：H1101H03）在高劑量1.67 mg/kg和低劑量0.5 mg/kg下，被動皮膚過敏反應均為陰性。結果見表6。

表6 藍斑直徑匯總

2.3 溶血試驗 陰性對照未見溶血或紅細胞凝聚，陽性對照可見溶血，表明本實驗中實驗系統(tǒng)可靠有效。受試物1～5號管（藥物濃度1 mg/mL，試管中濃度依次0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL）在3 h觀察時間內，受試物1～5號管未見有溶血現(xiàn)象，拍照后輕輕搖晃試管，各管管底紅細胞能分散，未見紅細胞凝聚現(xiàn)象。對照品1～5號管（藥物濃度1 mg/mL，試管中濃度依次0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL）在3 h觀察時間內，對照品1～5號管未見有溶血現(xiàn)象，拍照后輕輕搖晃試管，各管管底紅細胞能分散，未見紅細胞凝聚現(xiàn)象，受試物和對照品無溶血現(xiàn)象。具體結果見表7～8。

表7 伊班膦酸鈉注射液溶血試驗結果-受試物

表8 伊班膦酸鈉注射液溶血試驗結果-對照品

2.4 血管刺激性試驗 在給藥期和恢復期肉眼觀察血管，受試物組和對照品組各例兔耳均無明顯刺激性。病理檢查顯示給藥末期，受試物組（受試物）見1例兔耳血管近段內皮細胞輕微腫脹，少量中性粒細胞邊集，其余各組各例兔耳血管均未見明顯病變。恢復期，受試物組（受試物）及對照品組（溶媒對照品）各見1例兔耳血管中段內皮細胞輕微腫脹。受試物與對照品均未引起注射局部血管明顯的病理改變。結果表明，受試物和對照品對兔耳血管無刺激性。圖片見圖1～12。

圖1 受試物組左側T3451 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖2 受試物組右側T3451 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖3 受試物組左側T3451 號中段 HE ×200 未見明顯病變。

圖4 受試物組右側T3451 號中段 HE ×200未見明顯病變。

圖5 受試物組左側T3451 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

圖6 受試物組右側T3451 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

圖7 對照品組左側T3453 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖8 對照品組右側T3453 號近段 HE ×200未見明顯病變。

圖9 對照品組左側T3453 號中段 HE ×200未見明顯病變。

圖10 對照品組右側T3453 號中段 HE ×200未見明顯病變。

圖11 對照品組左側T3453 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

圖12 對照品組右側T3453 號遠段 HE ×200未見明顯病變。

3 討論

伊班膦酸鈉注射液臨床用于治療骨質疏松癥，肺癌并骨轉移，肝癌并骨轉移，乳腺癌并骨轉移等惡性腫瘤骨轉移疾病，耐受性及效果良好[5-16]。也有實驗表明，伊班膦酸鈉可減輕牙根吸收程度，預防牙根吸收，減緩正畸牙齒移動。伊班膦酸鈉抑制破骨細胞的活性從而抑制骨吸收的特性在口腔醫(yī)學領域中被廣泛應用[17]。本實驗從過敏性、溶血性及局部刺激性方面比較了制劑（南京恒生制藥有限公司）和參比制劑（Roche Pharma(Schweiz)Ltd）的毒性。結果表明兩種制劑均無過敏性，溶血性和刺激性，毒性反應一致。