廈門市生鮮水產品中創傷弧菌基因分型及耐藥性研究

◎陳佳璐

（廈門市食品藥品質量檢驗研究院,廈門 361012）

創傷弧菌（Vibrio vulnificus）屬于弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性、嗜鹽、氧化酶陽性、兼性厭氧、有莢膜、不產芽孢、有動力的弧菌[1]。創傷弧菌是引起人獸共患病的病原菌，食用受創傷弧菌污染的海產品或水源，或是創口接觸了帶菌的海水或海洋動物，都有可能感染上創傷弧菌。受到該菌感染后的臨床表現主要有原發性敗血癥、傷口感染及急性胃腸炎三大癥狀[2]，敗血癥和傷口感染都以宿主組織中細菌極快復制和皮膚組織廣泛損傷而聞名，即使進行了治療，敗血癥的死亡率也可高達75%，傷口感染的死亡率可高達50%。該細菌廣泛存在于亞熱帶海洋環境及海產品中，當海水溫度持續2 周以上超過20 ℃時，創傷弧菌會大量繁殖。廈門地處我國東南沿海，屬于亞熱帶地區，當地水產品種類豐富，海水水溫適宜創傷弧菌的生長。為了解廈門地區水產品中創傷弧菌的污染情況，本研究依據GB 4789.44-2020 中的檢驗方法對2021-2022 年廈門地區市售的210 份水產品進行創傷弧菌的檢測，結合PCR 及VITEK 對分離株進行毒力基因及耐藥性檢測，以期為水產品創傷弧菌監測工作的深入開展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

采集廈門地區農貿市場和超市出售的新鮮水產品，涉及海水魚、淡水魚及貝類。

1.2 儀器與試劑

CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司生產；Powerpac 基礎電泳儀，美國Bio-Rad 公司生產；Gel Doc XR 凝膠成像系統，美國Bio-Rad 公司生產；VITEK 2 全自動細菌鑒定儀，法國生物梅里埃公司生產；Centrifuge 5424 微量離心機，德國eppendorf 公司生產。

細菌分離用培養基購于青島海博生物技術有限公司、北京陸橋技術有限公司及上海欣中生物工程有限公司，瓊脂糖、Taq PCR 預混液、5×TBE、Gelred 染料購于生物工程（上海）股份有限公司，DNA 分子量標準Marker 購于北京索萊寶科技有限公司，革蘭氏陰性菌鑒定卡及藥敏鑒定卡購于法國梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

現場采集完整個體，置4 ℃保存，4 h 內送實驗室檢測。

1.3.2 創傷弧菌分離培養

魚類取其鰓、內臟等易富集微生物的部位，貝類去殼取可食整體部分，共計25 g，剪碎后加入225 mL PNCC 增菌液，36 ℃增菌18 h，轉種纖維二糖-多黏菌素E（CC）瓊脂平板及改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）瓊脂平板，36 ℃培養18 h，挑取可疑菌落，接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂平板，36 ℃純培養18 h。

1.3.3 生化實驗

經革蘭氏染色、氧化酶試驗、三糖鐵實驗及嗜鹽性試驗后，再采用梅里埃生物公司革蘭氏陰性鑒定卡鑒定。

1.3.4 藥敏實驗

取一個或多個純培養菌落，制成菌懸液，將菌懸液和藥敏卡放入VITEK 鑒定儀自動判讀數據并給予結果，共檢測25 種抗生素。

1.3.5 基因分型

依據GB 4789.44-2020 中的方法對創傷弧菌進行毒力相關基因（vcgC/E）、16S rRNA 基因分型（16S rRNA A/B）、生物Ⅱ型（Bt2）和血清E 型（SerE）檢測。

1.3.6 AmpC 酶的檢測

提取創傷弧菌的粗酶，通過三維實驗進行確證[3]，若看到狹縫與抑菌環交界處的抑菌環變形，細菌擴大生長，可判斷結果為陽性。若抑菌環呈圓形，沒有細菌擴大生長現象則結果為陰性。

2 結果與分析

2.1 創傷弧菌的污染情況

在210 份水產品中，有69 份檢出創傷弧菌，檢出率32.85%。其中，貝類檢出率達43.33%，其次為海水魚26.03%及淡水魚23.40%。見表1。

表1 各類水產品中創傷弧菌的檢出率表

2.2 創傷弧菌核酸檢測與基因分型

對69 株創傷弧菌進行PCR 檢測，結果顯示所有菌株均為溶血素A 基因（vvhA）核酸陽性，未檢出血清E 型；檢出6 株Bt2 核酸陽性，為生物Ⅱ型；vcgC/E 和16SrRNA A/B 分型結果顯示有4 種基因型，分別為vcgC 和16SrRNA B（CB 型）53 株，vcgC、16SrRNA A 和B（CAB 型）8 株，vcgE 和16SrRNA（EA型）7 株，vcgC 和16SrRNA A（CA 型）1 株，具體結果見表2。

表2 各類生鮮水產品中創傷弧菌的基因分型表

2.3 創傷弧菌體外藥物敏感性

22 種抗菌素藥物包括β-內酰胺酶抑制劑、青霉素類、單環素類、頭孢類、頭霉素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類等共8 類藥物。69 株創傷弧菌的藥敏實驗結果顯示，僅有8 種抗菌素藥物100%敏感，其他14 種抗菌素藥物均出現不同程度的耐藥性，其中，68 株創傷弧菌均對頭孢西丁耐藥，耐藥率98.55%，見表3。69 株創傷弧菌中有12 株菌對2 種以上藥物耐藥，其樣品來源及基因型別見表4。

表3 創傷弧菌藥敏實驗結果表

表4 耐藥菌株的樣品來源及基因型別表

3 結論與討論

由于創傷弧菌的嗜鹽性使其廣泛存在于海水及水產品中，與霍亂弧菌和副溶血性弧菌同屬致病性弧菌，是水產養殖中危害較大的一類致病菌。Yano等[4]研究顯示，我國零售海產品創傷弧菌污染率為33%。曹敏華等[5]研究顯示，珠海地區海產品創傷弧菌的污染率為43.82%。本次研究結果顯示，廈門地區水產品創傷弧菌的污染率為32.85%，其中貝類產品污染最為嚴重，檢出率高達43.33%。造成貝類污染率較高的原因可能與其是濾食性生物有關，這種進食方式使創傷弧菌易被濃縮在腸道和其他組織中。同時，近年來在部分內陸地區的淡水產品中均發現不同程度的致病性弧菌污染[6-8]。本研究發現廈門地區淡水產品也存在創傷弧菌的感染，淡水魚中創傷弧菌的檢出率為23.40%，說明在銷售環節采樣的淡水產品受到創傷弧菌的污染。采樣過程中發現同一商鋪同時售賣海水產品和淡水產品，水體可能存在交叉污染，從而造成淡水產品也攜帶創傷弧菌。

vcgC/E 和16SrRNA A/B 分型結果表明，廈門市售水產品中創傷弧菌基因型呈多樣性分布，分別有CB 型、CAB 型、EA 型及CA 型。其中以CB 型為主，存在于所有本次調查的3 大類水產品中，占所測菌株的76.81%，CB 型也是臨床分離創傷弧菌的主要基因型[9]。其次為CAB 型及EA 型，占比分別為11.59%及10.14%，貝類產品未檢出EA 型及CA 型，CA 型只從淡水魚中檢出一株，其他水產品中均未檢出。相關流行病學資料顯示[10]，不同基因型可能具有不同的致病潛能，CB 型被認為是一種在臨床上潛在的致病基因型，如生食、半生食水產品或是在產品加工處理過程中，一旦手上有傷口，都有感染創傷弧菌的風險。

本研究藥敏實驗結果表明，該菌對β-內酰胺酶抑制劑、青霉素類、單環素類、頭孢類、頭霉素類、氨基糖苷類藥物有不同程度的耐藥性。69 株樣品中，其中，對頭霉素類藥物的頭孢西丁耐藥的菌株有68 株（98.55%），對頭孢類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有38 株（55.07%），主要是分布在第一代頭孢（頭孢唑啉）、第二代頭孢（頭孢呋辛、頭孢呋辛酯），而對第三代頭孢（頭孢他啶、頭孢曲松）及第四代頭孢（頭孢吡肟）則表現為100%敏感。對氨基糖苷類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有10 株（14.49%），對單環素類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有7 株（10.14%），對青霉素類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有6 株（8.70%），對β-內酰胺酶抑制劑類藥物耐藥和中度耐藥的菌株有3 株（4.35%）。結果顯示，創傷弧菌對第三代和第四代頭孢、碳青霉烯類及氟喹諾酮類藥物敏感，可作為治療疑似創傷弧菌感染的優先選擇藥物。

AmpC 酶是革蘭氏陰性菌主要產生的β-內酰胺酶之一，按照分子分類法，屬于C 類酶，可以水解頭霉素類抗生素。頭孢西丁對高產AmpC 酶的細菌常表現為耐藥，因此，用三維實驗對69 株創傷弧菌進行AmpC 酶檢測，雖然69 株創傷弧菌均未檢出AmpC 酶，但已有研究表明在副溶血性弧菌中檢出AmpC 酶[11]，而質粒介導的AmpC 酶的出現，表明AmpC 酶的耐藥基因可以通過質粒在細菌間互相傳播，導致耐藥菌的廣泛傳播[12]。

以上討論結果顯示廈門地區市售生鮮水產中創傷弧菌的污染情況不容忽視，有潛在的致病風險，應持續對其加強監測并進行深入研究。