不同提取方法對(duì)檢測(cè)奶酪樣品二噁英的結(jié)果差異分析

◎?qū)O 炎

（中檢科（北京）測(cè)試技術(shù)有限公司，北京 100176）

1 不同前處理方法測(cè)定粗脂肪及凈化檢測(cè)

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

將人使用攪碎機(jī)研磨成細(xì)末，并混合均勻，置于5 ℃條件冷藏保存。主要試劑：正己烷、二氯甲烷、丙酮、甲苯、乙酸乙酯、正壬烷、濃硫酸、無水硫酸鈉、細(xì)顆粒硅膠、硅藻土。所需試劑均需進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，試劑濃縮至500 倍后不得檢出二噁英類物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)溶液均為加拿大威靈頓成品標(biāo)準(zhǔn)溶液EPA-1613ISS、EPA-1613LCS、PCB-LCS-A100、PCB-IS-B100、校 正溶液（CS1-5）。

前處理所需儀器主要包括分析天平（梅特勒有限公司ME204E）；快速溶劑萃?。绹惸wASE350）；二噁英凈化系統(tǒng)（美國FMS 公司）；冷凍干燥機(jī)（美國Virtis 公司adVantage Plus）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社NVC-2000）；氮吹濃縮儀（美國Organomation）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

測(cè)定脂肪時(shí)，當(dāng)提取脂肪質(zhì)量＞3 g 時(shí)，所計(jì)算的脂肪含量較為精確。新鮮奶酪的脂肪含量可以達(dá)到12%以上，而成熟奶酪通常含有20%～30%的脂肪[1]。在稱取奶酪樣品時(shí)，稱取15 g 左右樣品保證脂肪提取量。為比較水分對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，對(duì)樣品不進(jìn)行任何處理即進(jìn)行冷凍干燥，比較水分對(duì)檢測(cè)的影響。

1.2.1 加速溶劑萃取法

稱取適量奶酪樣品，轉(zhuǎn)入研缽中，進(jìn)行冷凍干燥。調(diào)節(jié)冷凍干燥機(jī)隔板溫度20 ℃，冷阱溫度-80 ℃，真空度350 mbar，冷凍干燥24 h。取出觀察樣品，在完全脫水后進(jìn)行后續(xù)操作。將冷凍干燥后的樣品加入適量硅藻土，并充分研磨混合，打開清洗過的快速溶劑萃取儀配套萃取池，將研磨好的樣品轉(zhuǎn)入萃取池中；稱取適量未經(jīng)干燥的奶酪樣品，加入適量硅藻土中充分研磨，保證樣品與硅藻土混合成粉末不結(jié)塊，將混合物轉(zhuǎn)入萃取池中，向上述萃取池中加入PCDDs/Fs 提取內(nèi)標(biāo)EPA-1613-LCS，PCBs 提取內(nèi)標(biāo)PCB-LCS-A100 各5 μL，旋緊提取池蓋密封等待提取。

設(shè)置快速溶劑萃取儀，并設(shè)置萃取池溫度為150 ℃，保持壓力1 500 psi，釋放壓力1 700 psi，循環(huán)時(shí)間8 min，循環(huán)次數(shù)3 次，提取試劑是正己烷與二氯甲烷，其比例為1 ∶1。檢查氮?dú)鈮毫?，啟?dòng)儀器進(jìn)行預(yù)熱。將已經(jīng)密封好的樣品池放入萃取池托盤中，將提取瓶放入與提取池所對(duì)應(yīng)編號(hào)的提取池托盤中，啟動(dòng)儀器進(jìn)行萃取。

1.2.2 索氏提取法樣品制備

同樣稱取上述奶酪樣品。在冷凍干燥的樣品中加入適量無水硫酸鈉充分研磨；在未干燥的樣品中加入適量無水硫酸鈉研末至干燥可自由流動(dòng)的粉末，將上述研磨好樣品小心轉(zhuǎn)入玻璃纖維套筒中，將盛有樣品的玻璃纖維套筒放入索氏提取器中，在玻璃纖維套筒中小心加入PCDDs/Fs 及PCBs 提取內(nèi)標(biāo)各5 μL，等待提取。將索氏提取器連接好，打開水冷先使提取器中的冷卻液降到適宜溫度。再使用提取試劑（正己烷∶二氯甲烷為1 ∶1）進(jìn)行提取，在燒瓶中加入200 mL溶劑，設(shè)置電熱套溫度，保證每小時(shí)回流3～5 次，觀察虹吸是否正常，提取24 h，同時(shí)測(cè)定后續(xù)樣品。

1.3 脂肪測(cè)定

濃縮前準(zhǔn)確稱取圓底燒瓶質(zhì)量并記錄，將提取液轉(zhuǎn)入已稱重的圓底燒瓶中，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行樣品濃縮，將提取液中的試劑蒸干后稱量圓底燒瓶質(zhì)量并記錄，將圓底燒瓶放在通風(fēng)處晾干，直至質(zhì)量不再變化，再計(jì)算脂肪含量。

脂肪測(cè)定公式：

式中：X為脂肪含量，%；m1為試樣的脂肪量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g，計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

1.4 樣品的凈化分離

在測(cè)定脂肪后的樣品中加入150 mL 正己烷，使用超聲波振蕩將油脂完全溶解，分次加入33%的酸化硅膠振蕩，硅膠以上的溶液為澄清液。通過無水硫酸鈉去除上層清液溶劑中的水分，所分離濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1～2 mL。

使用全自動(dòng)樣品凈化系統(tǒng)對(duì)濃縮后的樣品進(jìn)行凈化分離，使用電腦自動(dòng)控制有機(jī)溶液的用量、流速以及流動(dòng)方向，并收集PCDDs/Fs 及PCBs 組分洗脫液。

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將洗脫液蒸至近干，然后將濃縮液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，重復(fù)潤洗2次。用氮吹儀進(jìn)行濃縮，并反復(fù)用正己烷沖洗樣品瓶?jī)?nèi)壁，將洗液一并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，直至將液體濃縮 至10 μL 左右。

向PCDDs/Fs 組分小瓶中加入5 μL 進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)EPA-1613ISS，渦旋混勻后進(jìn)行分析。因活性炭柱可將PCDDs/Fs 與非鄰位取代的PCBs 組分同時(shí)吸附，所以待PCDDs/Fs 組分分析完成后，將PCBs 組分按照上述方法濃縮至PCDDs/Fs 組分小瓶中。加入5 μL 進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)PCB-IS-B1OO 渦旋混勻后再進(jìn)行分析。

1.5 氣相色譜分析條件及結(jié)果計(jì)算

進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣1 μL；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；載氣流量：1.0 mL/min；傳輸線溫度：290 ℃；色譜柱：固定相5%苯基，95%聚甲基硅氧烷，柱長60 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm。PCDDs/Fs 升溫程序：初始溫度140 ℃，保持1 min；以20 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升溫至220 ℃，保持16 min；以5 ℃/min 升溫至230 ℃，保持7 min；以 5 ℃/min 升溫至330 ℃，保持10 min。PCBs 升溫程序：初始溫度100 ℃，保持3 min；以30 ℃/min 升溫至210 ℃，保持1 min；以2 ℃/min 升溫至270 ℃后，以30 ℃/min 升溫至330 ℃，保持3 min。

高分辨質(zhì)譜分析條件：電子轟擊離子源，電子加速電壓可在25～70 V 調(diào)節(jié)；具有選擇離子檢測(cè)功能，并使用鎖定質(zhì)量模式進(jìn)行質(zhì)量校正；動(dòng)態(tài)分辨率＞1 萬并至少可穩(wěn)定24 h 以上。當(dāng)使用的內(nèi)標(biāo)包含13C-OCDF 時(shí)，動(dòng)態(tài)分辨率應(yīng)＞1.2 萬。高分辨狀態(tài)下能夠在1 s 內(nèi)重復(fù)監(jiān)測(cè)12 個(gè)選擇離子[2]。結(jié)果計(jì)算：使用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法定量測(cè)定試樣中各目標(biāo)化合物含量；采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算同位素內(nèi)標(biāo)化合物的回收率[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪測(cè)定比較

在奶和奶制品中，二噁英的限量標(biāo)準(zhǔn)以脂肪含量表示，使用同批樣品測(cè)定6 次，計(jì)算平均脂肪含量，同時(shí)使用GB5413.3-2010 中第一法哥特里-羅紫法測(cè)定脂肪含量。干樣索氏提取法19.87%，干樣加速萃取法23.94%，干樣哥特里-羅紫法24.91%，鮮樣索氏提取法18.02%，鮮樣加速萃取法23.33%，鮮樣哥特里-羅紫法25.04%。

哥特里-羅紫法是利用氨溶液使乳中酪蛋白的鈣鹽成為可溶性鈣鹽，使結(jié)合的脂肪游離[4]，測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。使用加速萃取法測(cè)定脂肪含量最接近哥特里-羅紫法差，測(cè)定值距較小，在使用干燥后樣品進(jìn)行提取時(shí)測(cè)定脂肪含量，更接近哥特里-羅紫法測(cè)定值，數(shù)據(jù)也更加穩(wěn)定。

2.2 檢測(cè)PCDDs/Fs 與PCBs 的結(jié)果比較

使用干燥后的樣品進(jìn)行提取，加速溶劑萃取法的全重計(jì)算結(jié)果略高于索氏提取法的全重計(jì)算結(jié)果。因使用快速溶劑萃取儀進(jìn)行提取時(shí)需要加溫至150 ℃，加壓至1 700 psi，可以改變奶酪中的酪氨酸鈣鹽的性質(zhì)，可以使溶劑將樣品中的PCDDs/Fsy 充分提取出來。索氏提取是直接利用溶劑不斷沖洗樣品，將樣品中的脂肪及PCDDs/Fs 等物質(zhì)洗脫下來，樣品不易被完全提取。

計(jì)算加速溶劑萃取法與索氏提取法檢測(cè)奶酪中PCBs 的TEQ 值，是用12 種具有二噁英毒性的化合物，以TEQ-WHO1998 進(jìn)行折算。用以上幾種前處理方法所檢測(cè)的PCBs 結(jié)果，與檢測(cè)PCDDs/Fs 的結(jié)果相似。使用索氏提取法的樣品結(jié)果均低于加速溶劑萃取法的結(jié)果，見表1。

表1 不同方法測(cè)定奶酪樣品PCDDs/Fs 及PCBs 的結(jié)果表（WHO1998-TEQ pg/g）

2.3 脂肪折算結(jié)果分析

根據(jù)結(jié)果分析顯示，以鮮重計(jì)二噁英類化合物的值低于冷凍干燥后樣品值，說明在奶酪樣品檢測(cè)二噁英類化合物的過程中，樣品的含水率影響最終的檢測(cè)結(jié)果。

使用索氏提取法比使用快速溶劑萃取法檢測(cè)二噁英類化合物的值偏低，是因?yàn)榭紤]到索氏提取法是依靠溶劑不斷沖洗樣品，將樣品中的二噁英類物質(zhì)洗脫出，在實(shí)際操作中亦受到樣品裝填密度、回流次數(shù)的變化等影響，沒有快速溶劑萃取儀萃取的加壓加溫的條件使樣品提取不完全[5]，脂肪折算數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同方法測(cè)定奶酪樣品使用脂肪含量折算PCDDs/Fs 的結(jié)果表（WHO1998-TEQ pg/g）

3 結(jié)論與展望

在不同的前處理方法中，奶酪樣品進(jìn)行冷凍干燥后，再使用加速溶劑萃取法進(jìn)行提取，在后續(xù)進(jìn)行樣品的凈化與分離時(shí)都比較順利，不會(huì)出現(xiàn)脂肪提取不完全、計(jì)算數(shù)值偏小的情況，在凈化過程中，提取物的狀態(tài)也利于樣品的凈化。使用其他方法時(shí)，會(huì)出現(xiàn)樣品在提取液中析出、凈化出現(xiàn)問題、脂肪測(cè)定不準(zhǔn)確的問題。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，在檢測(cè)奶酪樣品的二噁英類化合物時(shí)，推薦先將樣品凍干后再使用快速溶劑萃取法進(jìn)行提取，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行，可以較為準(zhǔn)確地測(cè)定樣品中二噁英類化合物的濃度。