動物源性食品中喹諾酮藥物的前處理提取優化研究

◎廖祺予

（四川省中安檢測有限公司，四川 成都 610100）

獸藥（Veterinary Drugs，VD）在獸醫業中廣泛應用于疾病治療和預防，也可以用來提升養殖的效率。如果獸藥使用不當，可能導致供人食用的動物源性食品中存在獸藥殘留，從而造成健康風險[1-2]。長期暴露在這種環境下，即使獸藥殘留的濃度很低，人群耐藥性也可能會提高，造成不良的影響。喹諾酮類藥物是一種抗微生物類的藥物，典型代表有諾氟沙星、丹諾沙星、氧氟沙星[3]，隨著各項技術的不斷發展，各種新的喹諾酮藥物的合成以及相應的檢測方法相繼問世。高效液相串聯質譜法（LC-MS）以其液相強大的分離功能和質譜強大的檢測功能等其他獨特的優勢，在檢測分析領域深受喜愛并廣泛應用，成為了國內外最常用的定量定性儀器[4]。

1 儀器設備試劑及標準物質

1.1 儀器設備

儀器型號廠家見表1。

表1 儀器型號廠家表

1.2 試劑

1.2.1 試劑信息

試劑純度廠家見表2。

表2 試劑純度廠家表

1.2.2 試劑的配置

（1）1%酸化乙腈：用10 mL 量筒量取0.01 L 甲酸，用玻璃棒轉移至1 L 的容量瓶內，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效使用期限30 d。

（2）20%甲醇水：用200 mL 量筒量取0.2 L 甲醇，用玻璃棒轉移至1 L 的容量瓶內，再用超純水清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內，最后再用超純水定容至容量瓶的刻度線，搖勻，有效使用期限30 d。

（3）0.1%甲酸：用1 mL 移液槍移取0.001 L 甲酸，轉移至1 L 的容量瓶內，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效期30 d。

（4）10%酸化乙腈：用100 mL量筒量取0.1 L甲酸，用玻璃棒轉移至1 L 的容量瓶內，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效期30 d。

（5）5%酸化乙腈：用100 mL 量筒取0.05 L 甲酸，用玻璃棒轉移到1 L 的容量瓶里，再用乙腈清洗量筒3 次，清洗液合并入量筒內，最后再用乙腈定容至刻度線，搖勻，有效期30 d。

2 實驗步驟

2.1 提取

本方法適用于動物蛋類，魚類，肌肉組織等動物源性食品中洛美沙星、恩諾沙星、單諾沙星等8 種喹諾酮類獸藥殘留量的測定。樣品利用酸化乙腈提取試樣中喹諾酮類化合物，利用凈化劑去除試樣中的油脂、水分、有機酸等，經LC-MS 測定，采用內標法定量[5]。

準確稱取5 g 左右樣品（精確到0.002 g）于50 mL 具塞離心管中，加入沙星類內標物標準工作液，加標樣品進行加標。加入20 mL 1%的甲酸乙腈，均質1 min 再用渦旋儀進行混勻，超聲提取30 min，4 000 r/min 離心5 min 再加入20 mL 1%甲酸乙腈第2 次重復提取，將2 次提取液合在一起，待凈化。

2.2 凈化

將合并后的提取液轉移到125 mL 分液漏斗中，于分層后的上清液中加入25 mL 正己烷（乙腈飽和），振蕩搖勻2 min，收集下層的乙腈溶液，舍棄上層的正己烷溶液，于40 ℃左右的旋蒸裝置中濃縮至近干，最后用高純度氮氣吹干。

2.3 溶劑置換

加入1 mL 20%甲醇-水溶解，在渦旋儀上混勻30 s，定容液過0.22 μm 的綠色有機濾膜，除去顆粒物等雜質后供LC-MS 上機測定。

2.4 儀器參考條件

2.4.1 液相色譜參考條件

進樣量為2μL，色譜柱為碳十八柱，色譜柱規格為1.8 μm 3.0 mm×50 mm，柱溫箱的溫度恒定為35 ℃，流速為0.3 mL/min，流動相為0.1%甲酸水和CH3OH，洗脫條件為梯度洗脫，詳情見表3。

表3 液相洗脫條件表

2.4.2 質譜參考條件

離子源溫度為350 ℃，MS 四級桿溫度為100 ℃，掃描方式為正離子，采集類型為全掃描模式掃描，電離方式為大氣壓電噴霧離子源，簡稱ESI 源。質譜采集條件見表4。

表4 質譜采集條件表

2.5 提取液的選擇

GB/T 20366-2006采用的提取液為2%的甲酸乙腈，但通過實驗發現，提取效果不佳，不能使8 種沙星的回收率同時保證在一個優良的條件下。據了解，川內實驗室多采用1%的甲酸乙腈進行提取，通過大量的實驗數據證明甲酸濃度在1%時，回收率是最為優良的，最終確定8 種沙星的提取液為1%的加甲酸乙腈。

通過對動物蛋類、魚類、肌肉組織3 種基質分別進行4 個梯度的實驗（甲酸濃度0%、1%、5%、10%），每個梯度進行3 平行試驗，RSD 在10%以內。得到加標回收率平均值，空白試驗無值，樣品本底無值，動物源性樣品在質譜普遍存在電荷競爭現象，會造成回收率的影響，但已經在GB/T 21312-2007 和GB/T 20366-2006 所規定的范圍（80%～120%），綜上，考慮使用回收率較為優良的1%的甲酸乙腈。

2.6 凈化方式的選擇

GB/T 21312-2007 采用的是固相萃取，固相萃取（SPE）的工作有2 種方式，第1 種就是通過吸附提取目標物，第2 種則是通過吸附生物雜質，固相生物萃取方法是基于化學色譜方法原理而發展起來的一項技術，樣品通過外界吹動裝置的正壓或者真空裝置的負壓或者兩者的聯合作用而通過SPE 小柱。由于不同固體上的吸附黏合劑可能會產生具有不同的有機官能基團，可以將特定的有機化合物固體吸附并將其保留在SPE 的圓柱上但該方法耗時長，操作煩瑣，且動物源性食品中的油脂等基質會堵塞SPE小柱，導致淋洗洗脫的困難，更為嚴重者則根本無法進行淋洗洗脫[5]。

QuEChERS（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe），是一種近幾年新發展起來比較熱門的一種凈化基質的構象與操作。但該方法中所使用的C18 雖然對動物源性食品中的油脂有很好的除雜功能，但同時通過大量實驗發現C18 會對目標物也造成影響，從而造成回收率的下降，達不到標準。

綜上，選擇了GB/T 20366-2006 中用正己烷來去除油脂等會造成基質抑制的雜質的方法，正己烷與油脂的極性相似，根據相似相溶原理，油脂會溶解在正己烷中，同時由于正己烷與乙腈的極性相差較大，不會相容，正己烷密度比乙腈小，所以說分層后正己烷層會在上層，乙腈層會在下層，這種方法既方便快捷，而且凈化的效果也好，回收率也保持在了一個優良的水平。

3 實驗驗證

3.1 線性范圍，相關系數，檢出限

根據線性范圍、檢出限分別配制濃度為0.5、1、2、4、8、16 μg/L 的6 個級別的標液。以儀器響應值為豎軸，濃度（μg/L）為橫軸。根據規定以10 倍信噪比（S/N=10）為檢出限，喹諾酮藥物的檢出限為0.5 ng/kg。對 比GB/T 21312-2007，1 ng/kg 的檢出限，該方法的檢出限更低，檢測更靈敏，滿足國家檢測要求。

3.2 精密度和回收率的檢測

回收率和精密度實驗以加標回收率為驗證標準，在食品中選取不含喹諾酮藥物的動物肌肉組織、魚肉、蛋類基質進行加標回收率驗證。根據國家標準GB/T 27404-2008中的相關規定選取1倍定量限1.5 μg/L、2 倍定量限3 μg/L、10 倍定量限15 μg/L 為該方法驗證的3 個加標水平用對樣品進行加標。進行3 個水平，每個水平六平行的回收率驗證實驗，按照前面所述的前處理方法進行實驗。實驗結果表明在不同的基質影響下加標回收和RSD 都保持在了一個良好的水平，且完全符合GB/T 27404-2008。

3.3 準確度實驗

用本方法測定有真值的質控樣品。平行測定 6次。測定值與真值見表5。各項測定結果都滿足GB/T 27404-2008 中各項相關規定，能夠很好地對待測樣品中的喹諾酮類藥物進行準確定量分析。

表5 測定值與真值表

4 結語

該方法改進了提取液中甲酸的濃度，通過對比各種酸度下乙腈的提取效果來選擇最優方案，提取效果用回收率表示，回收率為不同濃度下液相質譜串聯儀上的檢測結果濃度和加入濃度計算所得，根據結果顯示改進后的方法對于動物肌肉組織、魚類、蛋類有良好的檢測效果。在保持較好的靈敏度，準確度和精確度下，仍然能夠保持較好的回收率。并且前處理的方法比其他方法簡單快捷，適用的基質種類范圍也比較廣，在面對大批量的樣品時，能夠很好地節省人力和物力，提高檢測的效率。