微小RNA-155和腦源性神經生長因子在砷對PC12細胞損傷中的表達及意義*

孫寶飛，楊丹，羅道朋，曠發光，張金芬，吳昌學

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 人體解剖學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

砷是一種常見的神經毒物，亦可導致全身多臟器、多系統損傷，砷對神經系統的潛在損害風險已成為大眾關注的熱點問題[1]。由于神經細胞不能再生，并且神經組織對毒物的毒性作用較其他組織更為敏感，因此砷對神經系統的毒性作用研究顯得尤為重要[2-3]。流行病學證據表明，砷可穿過血腦屏障損傷腦組織，對人體中樞神經系統和外周神經系統均可造成不同程度損害，且砷致神經發育的毒性與劑量成正相關[4]。砷通過不同途徑進入機體后作用于中樞神經系統和外周神經系統，影響人或動物的神經系統功能及子代神經發育[5]。神經生長因子可促進神經細胞生長、增加突觸可塑性，在神經系統的發育及損傷修復中發揮重要作用[6]。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)能防止神經元受損傷死亡、改善神經元的病理狀態、促進受損傷神經元再生及分化等，是成熟的中樞及周圍神經系統的神經元維持生存及正常生理功能所必需的物質[7]。研究發現BDNF在阿茲海默癥綜合征、腦缺血損傷、帕金森氏綜合征、抑郁焦慮等疾病的保護和治療中發揮重要作用[8]。MicroRNAs (miRNAs) 是一類19 ～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通常靶向一個或多個mRNA，通過降解靶mRNA 或對其翻譯水平的抑制而調節基因轉錄后水平的表達[9]。表觀遺傳學揭示miRNAs具有可逆性，可廣泛應用于臨床研究和疾病治療等方面[10]。崔熠等[11]研究表明，表觀遺傳學修飾中發揮重要作用的miRNAs可受多種環境毒物影響，提示miRNAs在機體對環境有害化學物的反應中扮演重要的角色，且miRNAs還可作為環境污染物暴露后敏感的早期生物效應標志[12]。BDNF是microRNA-155(miR-155)和microRNA-365(miR-365)的共同靶基因。miR-155作為miRNAs的重要成員之一，主要通過與靶基因不完全性互補配對結合，進而抑制其翻譯過程，下調靶基因的表達水平[9]，通過轉染miRNAs下調BDNF表達可加劇BDNF/TrkB信號轉導通路的抑制狀態[13]。本研究以大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤12(adrenal pheochromocytoma 12，PC12)細胞作為研究對象，觀察不同劑量亞砷酸鈉(NaAsO2)對PC12細胞活力的影響及細胞內miR-155和BDNF的表達變化，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 PC12細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 NaAsO2(美國Merck公司)，DMEM/F-12培養基、胎牛血清 (美國Gibco公司)，BCA試劑盒(中國索萊寶公司)，β-actin一抗、BDNF一抗(武漢三鷹)，羊抗鼠IgG二抗(美國 Immunoway 公司)，MTT(江蘇碧云天生物技術研究所)，TRIzol (美國Invitrogen公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)，DMSO(美國Amresco公司)，SYBR Green(大連TaKaRa公司)，5%CO2培養箱，高速離心機(美國Thermo 公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養及建立染砷細胞模型 PC12細胞培養于含10%胎牛血清(DMEM/F-12)培養基中，37 ℃、5%CO2培養，隔天換液1次，2～3 d傳代1次(融合培養采用胰酶消化傳代)，取對數生長期的細胞備用；將NaAsO2用去離子水制成濃度為10 mmol/L的原液作為儲備液備用，存儲于4 ℃冰箱內。根據課題組前期及預實驗研究結果，以細胞存活率大于50%為原則設計染毒劑量和染毒時間，共設5組，即NaAsO2劑量分別為0(對照組)、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L(NaAsO2染毒組)，染毒時間為24 h。

1.2.2細胞存活率 各組PC12細胞加MTT溶液培養4 h，加DMSO，搖床震蕩10 min，在490 nm處測定光密度(OD)值，并計算細胞存活率[細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%]，確定NaAsO2對PC12細胞的IC50，重復3次。

1.2.3細胞超微結構 分別收集各組細胞懸液，0.25%胰酶消化，1 000 r /min 離心5 min，PBS洗滌2次，加4 ℃預冷的3%戊二醛固定2 h，洗滌2次；4 ℃ 預冷的1%鋨酸固定1 h，PBS 洗滌2次，乙醇脫水制樣，用透射掃描電子顯微鏡下(12 000×)觀察、并拍照。

1.2.4miR-155、BDNF mRNA相對表達量 按照1.2.1項操作后，消化并收集各組細胞、使用Trizol法提取總RNA，定量后按逆轉錄試劑盒操作說明在PCR儀上進行逆轉錄，反應結束后得到cDNA 并測純度。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，1 個循環，95 ℃變性10 s、60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環，重復3次，以GAPDH基因Ct 值為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因的相對水平，ΔΔCt=[(染毒組目的基因Ct值﹣染毒組內參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值)]。

1.2.5BDNF的表達水平 各組PC12細胞棄培養基，用200 μL裂解液(PMSF ∶RIPA為1 ∶100)裂解細胞30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒定量；加入5×Loading Buffer緩沖液，100 ℃煮沸蛋白10 min變性蛋白樣本、冷卻得到蛋白樣本；將蛋白樣本加至8%SDS-PAGE 凝膠中，按100 V、2 h進行電泳，以200 mA、2 h條件進行濕轉轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗(β-actin比例為1 ∶10 000，BDNF比例為1 ∶500)4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育2 h，ECL顯影(A液 ∶B液為1 ∶1)，使用多功能成像儀曝光、采圖、分析，重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞存活率

與對照組比較，NaAsO2各染毒組(除2.5 μmol/L組外)隨染毒劑量的增加，PC12細胞的存活率逐漸下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖1 不同濃度NaAsO2對PC12細胞存活率的影響(MTT)Fig.1 Survival rate in PC12 cells exposed to different doses of NaAsO2(MTT)

2.2 超微結構

電鏡下，對照組細胞染色質分布均勻，胞漿中等電子密度，細胞器豐富，細胞核形態規則，核膜光滑、完整，粗面內質網分布規則，網腔均勻一致，線粒體發達，其表面雙層膜和內部嵴清晰，高爾基復合體極性明顯，囊腔規則。見圖2A。NaAsO2濃度為5.0 μmol/L組中出現凋亡細胞，細胞表現為輕度皺縮、有少量細胞器凋亡形成的小泡，但尚可看到許多極性明顯的高爾基復合體以及雙層膜清晰連續、內部嵴完整的粗面內質網。見圖2B。NaAsO2濃度為20.0 μmol/L組細胞損傷嚴重，表現出細胞核溶解、胞體嚴重腫脹和不規則，染色質高密度聚集，核膜邊界不清、間隙增寬，有大量細胞器溶解形成的空泡。見圖2C。

注：A為對照組，B為5.0 μmol/L NaAsO2組，C 為20.0 μmol/L NaAsO2組。圖2 各組PC12細胞形態(透射電鏡，×12 000)Fig.2 Morphological characteristics of PC12 cells in each group (transmission electron microscope，×12 000)

2.3 miR-155、BDNF mRNA相對表達量

與對照組比較，NaAsO2染毒組(除2.5 μmol/L組外)PC12細胞中BDNF mRNA的相對表達量均減少，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-155的表達均升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖3 不同濃度NaAsO2對PC12細胞BDNF表達量的影響(RT-qPCR)Fig.3 Expression of BDNF in PC12 cell exposed to different doses of NaAsO2(RT-qPCR)

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖4 不同濃度NaAsO2對PC12細胞miR-155表達量的影響(RT-qPCR)Fig.4 Expression of miR-155 in PC12 cells exposed to different doses of NaAsO2(RT-qPCR)

2.4 BDNF蛋白表達水平

與對照組比較，NaAsO2染毒組(除2.5 μmol/L組外)PC12細胞中BDNF 蛋白表達量均減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為BDNF蛋白表達檢測結果，B為蛋白表達定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖5 不同濃度NaAsO2對PC12細胞BDNF蛋白表達水平的影響(Western blot)Fig.5 Expression of BDNF protein in PC12 cells exposed to different doses of NaAsO2(Western blot)

3 討論

慢性砷中毒可造成人體多器官損傷，砷已被國際癌癥研究機構確認為人類確定的Ⅰ類致癌物，可引起多種人體腫瘤的發生[14]。本研究采用不同劑量NaAsO2(0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)處理PC12細胞24 h后，與對照組相比，僅2.5 μmol/L NaAsO2組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)，其余各染毒組細胞存活率均下降，且隨著劑量的增大，細胞存活率逐漸降低，提示NaAsO2與其誘導的細胞凋亡具有一定劑量-反應關系。BDNF已被報道為突觸信號傳導的重要中介因子，BDNF與其他可塑性相關蛋白相互作用，介導運動誘導的海馬可塑性[15]。BDNF作為神經營養因子家族的一員，不僅能夠促進神經干細胞的增殖、遷移和分化，促進多種神經元的存活和生長發育，而且能促進突觸的可塑性，改變腦內神經元的形態，增加突觸終末的密度和促進樹突和軸突的生長[16]。本課題組前期研究證實在砷暴露的小鼠中，CA1和DG中的BDNF/磷酸化CREB(pCREB)減少[4]。本研究采用RT-qPCR技術，發現暴露于不同劑量NaAsO2的PC12細胞中BDNF mRNA的表達水平較對照組降低，且存在劑量-反應關系。這一結果，與張金雷等[17]對亞慢性砷暴露對大鼠海馬組織BDNF表達的影響研究結果相一致。采用Westen blot檢測NaAsO2染毒各組PC12細胞BDNF蛋白的表達水平均低于對照組，且與染毒NaAsO2濃度呈一定劑量-反應關系。在表觀遺傳修飾中有重要作用的miRNAs，可因環境物質引起異常表達[18]，且可能參與了毒物的代謝轉化和毒物誘導的細胞毒性、損傷修復及致癌過程[19]。Leah[20]研究發現，在炎癥刺激下，miR-155表達明顯上調，且抑制DNA修復的蛋白表達水平，導致基因的突變率升高，從而誘導癌癥發生。此外，王曉龍等[21]發現相較于癌旁黏膜組織，食管鱗癌組織中miR-155表達水平明顯降低，miR-155在其中可能起著抑癌基因的作用。本研究發現暴露于不同劑量NaAsO2下的PC12細胞miR-155表達水平較對照組高，其中存在量-效關系，提示NaAsO2暴露后可引起PC12細胞中miR-155表達水平升高。BDNF是miR-155和miR-365的共同靶基因。本研究通過蛋白印跡在PC12細胞中證實miR-155可能直接抑制靶基因BDNF的表達，提示NaAsO2暴露后，在PC12細胞中，隨著miR-155表達上調，BDNF表達降低，miR-155與BDNF呈明顯負相關。本研究結果顯示，miR-155在砷暴露的PC12細胞中特異性高表達，BDNF在砷暴露PC12細胞中特異性低表達，這與朱明亮等[22]在對多形性膠質瘤母細胞瘤患者血清中miR-155、miR-365和BDNF的表達及意義的研究結果一致。砷暴露后miR-155上調通過降低靶基因BDNF表達，減弱BDNF/TrkB/CREB信號通路活化，可能是砷造成突觸性損傷的重要機制，確切的機理還有待進一步研究。miR-155有可能作為砷致神經損傷的一個生物學標志。

綜上所述，砷具有神經毒性，染砷后神經細胞miR-155表達激活，BDNF表達降低，且呈現劑量-反應關系，這可能是砷致神經損傷的重要機制之一。本研究僅初步探討了BDNF在砷致神經細胞中的表達變化，還需利用干預實驗進一步驗證。