植物組織培養中抗污染培養基新配方初探

楊文雅

關鍵詞： 植物 組培 抗污染配方 培養基 紅掌組培苗

現階段，植物組織培養技術（tissue culture）屬于實操性非常強的生物技術，能夠分離一個或數個細胞或外植體。伴隨現代科學技術的快速發展，植物組織培養技術為相關科學實驗提供可靠證據，成為規模化、產量化生產種苗的廣泛性方法，其憑借可人為控制、生長周期短、繁育率高和可自動化控制管理等優勢，已經獲得迅速普及、應用[1]。植物組織培養技術關鍵的技術環節在于控制污染率，而雜菌污染屬于組織培養中培養基普遍存在污染問題。使用酒精和次氯酸溶液進行外植體消毒的過程，不僅消耗時間較長，同時操作流程較為繁瑣，存在較大的雜菌污染風險。這種方法容易導致植物組織培養過程出現疏漏，造成培養基被污染，這些污染的來源主要是真菌、細菌、雜菌。一旦雜菌和雜菌孢子污染植物組織培養基，約5 天后，在培養基表面和培養基內部會大量出現雜菌繁殖，同時還會分泌出具備酸性的有害物質，對培養的植物進行大批污染和毒害，造成植物培苗的死亡。有鑒于此，一旦在植物組織培養實驗中發生外植體雜菌污染，必須立即銷毀，控制雜菌污染率。

雜菌污染抑制了植物組織培養技術在農業生產中的廣泛推廣和利用，對農業的發展造成了直接影響。因此，對植物組織培養基實驗的細菌、雜菌抑制研究逐漸被提上日程，是未來研究的必然趨勢。該實驗前提是節約實驗室資源，以紅掌組織培養為實驗材料，添加銀粒子到培養基中，觀察培養基的生長情況以及抗雜菌污染效果，并對其中的組織實驗變化情況加以詳細的記錄與分析對比，獲得實際的、完整的組織實驗成果研究數據。以此探索一種成本低廉可靠、可以高效抵抗雜菌污染的抗污染配方及方法[2]。

1 實驗背景

以往的植物組織培養實驗過程中，不同的植物自身帶有一定的細菌，這些細菌多種多樣，所以為植物進行殺菌工作十分繁瑣與困難。如果沒有徹底地對植物攜帶的細菌進行殺除，就會將其帶進植物的培養基以內，導致培養基內發生雜菌的污染問題。這些不穩定因素，均會導致培養基污染的產生，會使實驗研究的植物組織培養基實驗數據造成偏差，導致實驗無法進行[3]。

隨著時代的變化，對植物培養基中的雜菌進行控制的科學技術手段也在不斷更新。通過實驗與探索，發現植物組織開放式的培養方式讓植物可以在開放式的載體中生長與變化，有效抑制雜菌產生。與此同時，可以對植物組織的培養工作加以簡單化轉換，從而降低實驗難度，節約植物組織實驗的經濟消耗成本，促進相關實驗成果的發展。此外，如果將有明顯控制作用的新配方抗污染制劑加入，將促組織培養具備更高培養價值。

2 材料與方法

2. 1 實驗材料

2.1.1 實驗試劑

利用不同的實驗試劑，如硝酸銀AgNO3、果糖、葡萄糖等。

2.1.2 實驗儀器

透射電子顯微鏡Transmission Electron Microscope，日立H-7650。

2.1.3 外植體材料及其生物學特性

紅掌組培苗及種子。紅掌（Anthurium andraeanumLinden）別名火鶴花、紅鵝掌、安祖花和紅燭等。紅掌以獨特的風姿給人以熱情、進取之感，屬于熱帶花卉名種，品種繁多，可以作為切花栽培，也可以作為盆花栽植。在規模化、產量化生產種苗的過程中，通常采用植物組織培養方式進行快速繁育，植物組織培養紅掌組培苗及種子是否能夠成功，是紅掌規模化、產量化育苗的關鍵環節。紅掌原產于熱帶雨林區，喜歡溫暖、潮濕的環境，生長對于溫度的要求較為嚴苛，通常適宜在20 ℃～30 ℃的環境存活，喜歡陽光但嚴格禁止被陽光直射，防止葉片、花苞片因為高溫產生灼傷、褪色，失去光澤，葉片生長緩慢。

2.1.4 實驗時間

2020 年3 月至2020 年12 月進行。

2. 2 制備植物組織培養基

2.2.1 納米銀溶膠的制備

在溫度40 ℃以下時，硝酸銀溶液濃度分別達到1.0×10?4、1.0×10?3、1.0×10?2時，分別在25 mL 硝酸銀溶液中加入5 mL 氨水溶液，同時將三口瓶分別置放于磁力攪拌器上進行均速攪拌，在溶液充分混合之后，分別再加入10 mL 的果糖溶液、5 mL 的葡萄糖溶液，靜置1 min 后，滴入0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，然后進行混合調節，調節要達到整個溶液的酸堿度為9 左右的pH值，具體反應需要滿足1.5 h。

2.2.2 納米銀粒子的表征

就納米銀粒子的表征而言，可以對細菌進行充分的抑制與消殺，并且不需要任何的化學或其他輔助成分的幫助?？梢杂糜谌藗內粘Ｉ钪械募毦麣?，對人們的健康防護具有一定的作用。在使用納米銀粒子的過程當中，只需要微量的粒子，就可以產生十分有效的殺菌作用，對細菌的生長、繁衍與轉變具有較大的抑制能力。有鑒于此，人們開始研究將其加入到植物組織的培養基實驗之中，是否能對細菌的生產產生較大的抑制影響，增加培養基的抗菌能力，從而對在植物組織培養基的實驗產生一定的推動作用，抑制雜菌生成。

該文實驗中主要利用果糖和葡萄糖為還原試劑，實驗在室溫下，水相體系中還原硝酸銀溶液之后得到納米銀溶膠。在實驗進行的過程中可以發現，實驗試劑顏色、粒子的大小、粒子的散落位置情況都出現了不同的變化。并在此過程之中，研究綜合性、整體性的變化與影響，從而給出結論。同使用有機溶劑作還原試劑的實驗相對比而言，在該實驗中使用果糖和葡萄糖更加具備環保屬性，綠色健康，而且果糖和葡萄糖可以同時作為植物組織培養基的能量來源物質，所制備出來的納米銀粒子可以添加到B5 培養基之中，在實驗中可以測試該復合培養基的具體抗菌性能[4]。

2.2.3 納米銀粒子復合B5 培養基制備

把3.02 g 的B5 干粉培養基溶解在100 mL 的去離子水之中，加熱到完全溶解，然后向去離子水中加入10 mL 的納米銀粒子的溶膠，再倒入潔凈的表面器皿之中。

2.2.4 最佳抑制雜菌配方對紅掌組培苗及種子生長的影響

為了驗證最佳抑制雜菌配方對紅掌組培苗及種子生長的影響，配制含有該配比配方培養基，同時配比更高濃度梯度的培養基，以不含納米銀粒子抑菌制劑的培養基為空白對照。

（1）采集與消毒。

采集紅掌組培苗根、莖、葉、花、芽及種子的子葉，也可以利用花粉粒和花藥，培養無病毒苗采用莖尖分生組織部分，長度約為0.1 mm。將紅掌組培苗莖尖分生組織部分用流水沖洗干凈，用蒸餾水沖洗后，使用無菌紗布將水分吸取干凈，使用消毒刀片將紅掌組培苗莖尖分生組織部分切成小塊。在無菌實驗環境中，將紅掌組培苗莖尖分生組織部分放置進入70% 酒精或次氯酸溶液中進行浸泡。30～60 s 后將紅掌組培苗莖尖分生組織部分移動至裝有漂白粉的飽和液中，或置放在汞水中消毒10 min，最后在取出時，使用無菌水進行沖洗，沖洗3～4 次后晾干備用。

（2）外植體制備。

使用消毒后的無菌刀、剪子和鑷子等，在無菌實驗環境下進行嫩枝外皮、種皮胚乳等的剝除。在外植體制備過程中，嚴格禁止實驗人員觸碰實驗用紅掌組培苗及種子。

（3）接種與培養。

在無菌實驗環境下，將已經切好的外植體接種在培養基上，每排培養基點播72 個外植體，每次處理重復8 次。成功接種后，使用無菌膠帶對培養皿進行封口，設置培養基處24 ℃溫度，濕度達到55%，要求每天記錄紅掌植株的生長情況與污染情況。外植體增值是植物組織培養關鍵，為擴大增值系數需要進行繼代培養。

2. 3 抗雜菌的性能測試

將納米銀溶膠添加到B5 培養基之中，然后把紅掌外植體放置在復合培養基上進行培養，伴隨培養基表面出現雜菌，將已經被污染的紅掌外植體組織置于1 500～2 000 lx 光照強度下，每天光照14 h，溫度保持在25 ℃左右[5]。

3 結果與分析

3. 1 納米銀粒子的主要表征

就納米銀粒子的主要表征而言，可以將納米銀粒子應用在植物組織的培養基實驗當中，在進行實驗反應的具體過程之中可以發現，伴隨著實驗反應的產生，納米銀粒子在制備反應開始前和開始后，其實驗反應開始出現不同的改變，其顏色的呈現最終變化成為了棕黃顏色：

這主要是因為納米銀粒子的表面等離子體產生了共振引起。

不同的硝酸銀濃度下制備納米銀粒子時，制備出的納米銀粒子表現為并不規則的球狀形狀，且保持較好的分散性。一旦硝酸銀的濃度達到：1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L；制備出的納米銀粒子對應的平均粒徑可以分別達到48 nm、55 nm、66 nm，將實驗之中的數據信息參數加以詳細的記錄，并在實驗完畢后，將這3 種濃度的硝酸銀濃度進行對比，發現當硝酸銀的濃度達到1.0×10?2 mol/L 時所制備出的納米銀粒子出現了塊狀銀顆粒，同時塊狀的銀顆粒的粒徑分布范圍比較寬，平均的寬度分布在45～98 nm 之間：

3. 2 具體抗菌性能測試

將紅掌處于兩種不同參數的B5 培養基上的培養狀態進行數據比較之后可以了解到，在進行實驗的第5 天，沒有添加納米銀溶膠的實驗培養基之中，紅掌表面和瓊脂進行接觸的周圍存在大量的霉菌和雜菌，同時，培養基表面也大量產生霉菌和雜菌；與這樣的結果有所不同，復合納米銀粒子B5 培養基沒有發生新型的細菌變化和生長，而當紅掌進行實驗過后，其紅掌的實驗結果顯示發生少數的表皮變化。實驗數據表明，納米銀粒子可以對不同的細菌產生較強的、十分有效果的抑制與抵抗作用，具有明顯的控制雜菌和霉變的效果[6]，其可以運用在植物組織培養基實驗中，推動相關實驗得以順利進行。

受雜菌污染干擾，將造成紅掌組培苗及種子的組織培養質量迅速下降，而現有抗污染技術過于強調無菌操作環境，雖然能在一定程度上減少污染，但是成本相對較高。在實驗的準備過程中，需要采取綠色、無毒的操作方法通過科學的實驗配比方法，對其按照穩定流程進行實驗，并將實驗數據加以詳細的數據信息記錄，并在實驗完畢后，對其進行準確的分析[7]。

在該次實驗中，實驗主要應用的原料為硝酸銀，以果糖和葡萄糖作為還原試劑。一旦硝酸銀的濃度分別達到1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L時，所制備出的納米銀粒子平均粒徑分別處于48 nm、55 nm、66 nm，鑒于此，將納米銀粒子科學添加到B5 植物培養基中，可以得到復合培養基，具有顯著的抗雜菌性能[8-9]。

4 結語

在進行植物組織培養的實驗過程之中，探索對環境沒有污染，并且成本較低的優良解決方法。該實驗進行了一種植物組織培養基抗雜菌污染的配方配比制備方法，需要對其原有的液體進行一定的還原處理工作，再將處理過后得到的新型粒子加入到內含植物組織的載體，也就是培養基之中，得到一種對雜菌性質具備一定抗體能力的復合培養基，利用現有的科學技術手段，對培養基內的污染因子加以管理和控制。該次實驗主要添加蔗糖作為能源物質，全部實驗過程無污染、安全綠色，并且具有成本小、經濟適用的特點，屬于一種可以進行全面推廣應用的納米銀粒子制備配比配方，能夠有效抑制真菌、細菌、雜菌生長，實驗的制備方法簡單可靠、容易操作，對植物無害，制備出的納米銀粒子粒徑非常均勻，而且顆粒的大小合適，同時狀態分布均勻。該實驗中的納米銀溶膠和紅掌組培苗及種子培養基的相容性明顯適合，該實驗有利于優化紅掌組培苗及種子滅菌保存效果，添加了納米銀溶膠的培養基具備較好的控制雜菌效果。