植物組織培養(yǎng)中抗污染培養(yǎng)基新配方初探

楊文雅

關(guān)鍵詞： 植物 組培 抗污染配方 培養(yǎng)基 紅掌組培苗

現(xiàn)階段，植物組織培養(yǎng)技術(shù)（tissue culture）屬于實(shí)操性非常強(qiáng)的生物技術(shù)，能夠分離一個(gè)或數(shù)個(gè)細(xì)胞或外植體。伴隨現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)為相關(guān)科學(xué)實(shí)驗(yàn)提供可靠證據(jù)，成為規(guī)模化、產(chǎn)量化生產(chǎn)種苗的廣泛性方法，其憑借可人為控制、生長周期短、繁育率高和可自動化控制管理等優(yōu)勢，已經(jīng)獲得迅速普及、應(yīng)用[1]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)在于控制污染率，而雜菌污染屬于組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基普遍存在污染問題。使用酒精和次氯酸溶液進(jìn)行外植體消毒的過程，不僅消耗時(shí)間較長，同時(shí)操作流程較為繁瑣，存在較大的雜菌污染風(fēng)險(xiǎn)。這種方法容易導(dǎo)致植物組織培養(yǎng)過程出現(xiàn)疏漏，造成培養(yǎng)基被污染，這些污染的來源主要是真菌、細(xì)菌、雜菌。一旦雜菌和雜菌孢子污染植物組織培養(yǎng)基，約5 天后，在培養(yǎng)基表面和培養(yǎng)基內(nèi)部會大量出現(xiàn)雜菌繁殖，同時(shí)還會分泌出具備酸性的有害物質(zhì)，對培養(yǎng)的植物進(jìn)行大批污染和毒害，造成植物培苗的死亡。有鑒于此，一旦在植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)生外植體雜菌污染，必須立即銷毀，控制雜菌污染率。

雜菌污染抑制了植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛推廣和利用，對農(nóng)業(yè)的發(fā)展造成了直接影響。因此，對植物組織培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌、雜菌抑制研究逐漸被提上日程，是未來研究的必然趨勢。該實(shí)驗(yàn)前提是節(jié)約實(shí)驗(yàn)室資源，以紅掌組織培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)材料，添加銀粒子到培養(yǎng)基中，觀察培養(yǎng)基的生長情況以及抗雜菌污染效果，并對其中的組織實(shí)驗(yàn)變化情況加以詳細(xì)的記錄與分析對比，獲得實(shí)際的、完整的組織實(shí)驗(yàn)成果研究數(shù)據(jù)。以此探索一種成本低廉可靠、可以高效抵抗雜菌污染的抗污染配方及方法[2]。

1 實(shí)驗(yàn)背景

以往的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中，不同的植物自身帶有一定的細(xì)菌，這些細(xì)菌多種多樣，所以為植物進(jìn)行殺菌工作十分繁瑣與困難。如果沒有徹底地對植物攜帶的細(xì)菌進(jìn)行殺除，就會將其帶進(jìn)植物的培養(yǎng)基以內(nèi)，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)生雜菌的污染問題。這些不穩(wěn)定因素，均會導(dǎo)致培養(yǎng)基污染的產(chǎn)生，會使實(shí)驗(yàn)研究的植物組織培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)造成偏差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行[3]。

隨著時(shí)代的變化，對植物培養(yǎng)基中的雜菌進(jìn)行控制的科學(xué)技術(shù)手段也在不斷更新。通過實(shí)驗(yàn)與探索，發(fā)現(xiàn)植物組織開放式的培養(yǎng)方式讓植物可以在開放式的載體中生長與變化，有效抑制雜菌產(chǎn)生。與此同時(shí)，可以對植物組織的培養(yǎng)工作加以簡單化轉(zhuǎn)換，從而降低實(shí)驗(yàn)難度，節(jié)約植物組織實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)消耗成本，促進(jìn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)成果的發(fā)展。此外，如果將有明顯控制作用的新配方抗污染制劑加入，將促組織培養(yǎng)具備更高培養(yǎng)價(jià)值。

2 材料與方法

2. 1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

利用不同的實(shí)驗(yàn)試劑，如硝酸銀AgNO3、果糖、葡萄糖等。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

透射電子顯微鏡Transmission Electron Microscope，日立H-7650。

2.1.3 外植體材料及其生物學(xué)特性

紅掌組培苗及種子。紅掌（Anthurium andraeanumLinden）別名火鶴花、紅鵝掌、安祖花和紅燭等。紅掌以獨(dú)特的風(fēng)姿給人以熱情、進(jìn)取之感，屬于熱帶花卉名種，品種繁多，可以作為切花栽培，也可以作為盆花栽植。在規(guī)模化、產(chǎn)量化生產(chǎn)種苗的過程中，通常采用植物組織培養(yǎng)方式進(jìn)行快速繁育，植物組織培養(yǎng)紅掌組培苗及種子是否能夠成功，是紅掌規(guī)模化、產(chǎn)量化育苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。紅掌原產(chǎn)于熱帶雨林區(qū)，喜歡溫暖、潮濕的環(huán)境，生長對于溫度的要求較為嚴(yán)苛，通常適宜在20 ℃～30 ℃的環(huán)境存活，喜歡陽光但嚴(yán)格禁止被陽光直射，防止葉片、花苞片因?yàn)楦邷禺a(chǎn)生灼傷、褪色，失去光澤，葉片生長緩慢。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)時(shí)間

2020 年3 月至2020 年12 月進(jìn)行。

2. 2 制備植物組織培養(yǎng)基

2.2.1 納米銀溶膠的制備

在溫度40 ℃以下時(shí)，硝酸銀溶液濃度分別達(dá)到1.0×10?4、1.0×10?3、1.0×10?2時(shí)，分別在25 mL 硝酸銀溶液中加入5 mL 氨水溶液，同時(shí)將三口瓶分別置放于磁力攪拌器上進(jìn)行均速攪拌，在溶液充分混合之后，分別再加入10 mL 的果糖溶液、5 mL 的葡萄糖溶液，靜置1 min 后，滴入0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，然后進(jìn)行混合調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)要達(dá)到整個(gè)溶液的酸堿度為9 左右的pH值，具體反應(yīng)需要滿足1.5 h。

2.2.2 納米銀粒子的表征

就納米銀粒子的表征而言，可以對細(xì)菌進(jìn)行充分的抑制與消殺，并且不需要任何的化學(xué)或其他輔助成分的幫助。可以用于人們?nèi)粘Ｉ钪械募?xì)菌消殺，對人們的健康防護(hù)具有一定的作用。在使用納米銀粒子的過程當(dāng)中，只需要微量的粒子，就可以產(chǎn)生十分有效的殺菌作用，對細(xì)菌的生長、繁衍與轉(zhuǎn)變具有較大的抑制能力。有鑒于此，人們開始研究將其加入到植物組織的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)之中，是否能對細(xì)菌的生產(chǎn)產(chǎn)生較大的抑制影響，增加培養(yǎng)基的抗菌能力，從而對在植物組織培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生一定的推動作用，抑制雜菌生成。

該文實(shí)驗(yàn)中主要利用果糖和葡萄糖為還原試劑，實(shí)驗(yàn)在室溫下，水相體系中還原硝酸銀溶液之后得到納米銀溶膠。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過程中可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)試劑顏色、粒子的大小、粒子的散落位置情況都出現(xiàn)了不同的變化。并在此過程之中，研究綜合性、整體性的變化與影響，從而給出結(jié)論。同使用有機(jī)溶劑作還原試劑的實(shí)驗(yàn)相對比而言，在該實(shí)驗(yàn)中使用果糖和葡萄糖更加具備環(huán)保屬性，綠色健康，而且果糖和葡萄糖可以同時(shí)作為植物組織培養(yǎng)基的能量來源物質(zhì)，所制備出來的納米銀粒子可以添加到B5 培養(yǎng)基之中，在實(shí)驗(yàn)中可以測試該復(fù)合培養(yǎng)基的具體抗菌性能[4]。

2.2.3 納米銀粒子復(fù)合B5 培養(yǎng)基制備

把3.02 g 的B5 干粉培養(yǎng)基溶解在100 mL 的去離子水之中，加熱到完全溶解，然后向去離子水中加入10 mL 的納米銀粒子的溶膠，再倒入潔凈的表面器皿之中。

2.2.4 最佳抑制雜菌配方對紅掌組培苗及種子生長的影響

為了驗(yàn)證最佳抑制雜菌配方對紅掌組培苗及種子生長的影響，配制含有該配比配方培養(yǎng)基，同時(shí)配比更高濃度梯度的培養(yǎng)基，以不含納米銀粒子抑菌制劑的培養(yǎng)基為空白對照。

（1）采集與消毒。

采集紅掌組培苗根、莖、葉、花、芽及種子的子葉，也可以利用花粉粒和花藥，培養(yǎng)無病毒苗采用莖尖分生組織部分，長度約為0.1 mm。將紅掌組培苗莖尖分生組織部分用流水沖洗干凈，用蒸餾水沖洗后，使用無菌紗布將水分吸取干凈，使用消毒刀片將紅掌組培苗莖尖分生組織部分切成小塊。在無菌實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，將紅掌組培苗莖尖分生組織部分放置進(jìn)入70% 酒精或次氯酸溶液中進(jìn)行浸泡。30～60 s 后將紅掌組培苗莖尖分生組織部分移動至裝有漂白粉的飽和液中，或置放在汞水中消毒10 min，最后在取出時(shí)，使用無菌水進(jìn)行沖洗，沖洗3～4 次后晾干備用。

（2）外植體制備。

使用消毒后的無菌刀、剪子和鑷子等，在無菌實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行嫩枝外皮、種皮胚乳等的剝除。在外植體制備過程中，嚴(yán)格禁止實(shí)驗(yàn)人員觸碰實(shí)驗(yàn)用紅掌組培苗及種子。

（3）接種與培養(yǎng)。

在無菌實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，將已經(jīng)切好的外植體接種在培養(yǎng)基上，每排培養(yǎng)基點(diǎn)播72 個(gè)外植體，每次處理重復(fù)8 次。成功接種后，使用無菌膠帶對培養(yǎng)皿進(jìn)行封口，設(shè)置培養(yǎng)基處24 ℃溫度，濕度達(dá)到55%，要求每天記錄紅掌植株的生長情況與污染情況。外植體增值是植物組織培養(yǎng)關(guān)鍵，為擴(kuò)大增值系數(shù)需要進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

2. 3 抗雜菌的性能測試

將納米銀溶膠添加到B5 培養(yǎng)基之中，然后把紅掌外植體放置在復(fù)合培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，伴隨培養(yǎng)基表面出現(xiàn)雜菌，將已經(jīng)被污染的紅掌外植體組織置于1 500～2 000 lx 光照強(qiáng)度下，每天光照14 h，溫度保持在25 ℃左右[5]。

3 結(jié)果與分析

3. 1 納米銀粒子的主要表征

就納米銀粒子的主要表征而言，可以將納米銀粒子應(yīng)用在植物組織的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的具體過程之中可以發(fā)現(xiàn)，伴隨著實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的產(chǎn)生，納米銀粒子在制備反應(yīng)開始前和開始后，其實(shí)驗(yàn)反應(yīng)開始出現(xiàn)不同的改變，其顏色的呈現(xiàn)最終變化成為了棕黃顏色：

這主要是因?yàn)榧{米銀粒子的表面等離子體產(chǎn)生了共振引起。

不同的硝酸銀濃度下制備納米銀粒子時(shí)，制備出的納米銀粒子表現(xiàn)為并不規(guī)則的球狀形狀，且保持較好的分散性。一旦硝酸銀的濃度達(dá)到：1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L；制備出的納米銀粒子對應(yīng)的平均粒徑可以分別達(dá)到48 nm、55 nm、66 nm，將實(shí)驗(yàn)之中的數(shù)據(jù)信息參數(shù)加以詳細(xì)的記錄，并在實(shí)驗(yàn)完畢后，將這3 種濃度的硝酸銀濃度進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)硝酸銀的濃度達(dá)到1.0×10?2 mol/L 時(shí)所制備出的納米銀粒子出現(xiàn)了塊狀銀顆粒，同時(shí)塊狀的銀顆粒的粒徑分布范圍比較寬，平均的寬度分布在45～98 nm 之間：

3. 2 具體抗菌性能測試

將紅掌處于兩種不同參數(shù)的B5 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較之后可以了解到，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的第5 天，沒有添加納米銀溶膠的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基之中，紅掌表面和瓊脂進(jìn)行接觸的周圍存在大量的霉菌和雜菌，同時(shí)，培養(yǎng)基表面也大量產(chǎn)生霉菌和雜菌；與這樣的結(jié)果有所不同，復(fù)合納米銀粒子B5 培養(yǎng)基沒有發(fā)生新型的細(xì)菌變化和生長，而當(dāng)紅掌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過后，其紅掌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)生少數(shù)的表皮變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，納米銀粒子可以對不同的細(xì)菌產(chǎn)生較強(qiáng)的、十分有效果的抑制與抵抗作用，具有明顯的控制雜菌和霉變的效果[6]，其可以運(yùn)用在植物組織培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中，推動相關(guān)實(shí)驗(yàn)得以順利進(jìn)行。

受雜菌污染干擾，將造成紅掌組培苗及種子的組織培養(yǎng)質(zhì)量迅速下降，而現(xiàn)有抗污染技術(shù)過于強(qiáng)調(diào)無菌操作環(huán)境，雖然能在一定程度上減少污染，但是成本相對較高。在實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備過程中，需要采取綠色、無毒的操作方法通過科學(xué)的實(shí)驗(yàn)配比方法，對其按照穩(wěn)定流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以詳細(xì)的數(shù)據(jù)信息記錄，并在實(shí)驗(yàn)完畢后，對其進(jìn)行準(zhǔn)確的分析[7]。

在該次實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用的原料為硝酸銀，以果糖和葡萄糖作為還原試劑。一旦硝酸銀的濃度分別達(dá)到1.0×10?4 mol/L、1.0×10?3 mol/L、1.0×10?2 mol/L時(shí)，所制備出的納米銀粒子平均粒徑分別處于48 nm、55 nm、66 nm，鑒于此，將納米銀粒子科學(xué)添加到B5 植物培養(yǎng)基中，可以得到復(fù)合培養(yǎng)基，具有顯著的抗雜菌性能[8-9]。

4 結(jié)語

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過程之中，探索對環(huán)境沒有污染，并且成本較低的優(yōu)良解決方法。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一種植物組織培養(yǎng)基抗雜菌污染的配方配比制備方法，需要對其原有的液體進(jìn)行一定的還原處理工作，再將處理過后得到的新型粒子加入到內(nèi)含植物組織的載體，也就是培養(yǎng)基之中，得到一種對雜菌性質(zhì)具備一定抗體能力的復(fù)合培養(yǎng)基，利用現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)手段，對培養(yǎng)基內(nèi)的污染因子加以管理和控制。該次實(shí)驗(yàn)主要添加蔗糖作為能源物質(zhì)，全部實(shí)驗(yàn)過程無污染、安全綠色，并且具有成本小、經(jīng)濟(jì)適用的特點(diǎn)，屬于一種可以進(jìn)行全面推廣應(yīng)用的納米銀粒子制備配比配方，能夠有效抑制真菌、細(xì)菌、雜菌生長，實(shí)驗(yàn)的制備方法簡單可靠、容易操作，對植物無害，制備出的納米銀粒子粒徑非常均勻，而且顆粒的大小合適，同時(shí)狀態(tài)分布均勻。該實(shí)驗(yàn)中的納米銀溶膠和紅掌組培苗及種子培養(yǎng)基的相容性明顯適合，該實(shí)驗(yàn)有利于優(yōu)化紅掌組培苗及種子滅菌保存效果，添加了納米銀溶膠的培養(yǎng)基具備較好的控制雜菌效果。