血清lncRNA-GAS5及miR-451在重癥肺炎患兒中的表達水平及臨床意義*

李 娜,王維娟,曾靜霞

1.西北婦女兒童醫院兒科急診與PICU，陜西西安 710061;2.南京醫科大學附屬兒童醫院重癥醫學科，江蘇南京 210008

肺炎是兒童時期最為常見的呼吸道感染性疾病，是兒童死亡的重要原因。據流行病學調查結果顯示，每年5歲以下發生肺炎的兒童約為5億，其中有將近10%會發展成為重癥肺炎[1-2]。在我國，每年患肺炎的兒童人數在2 000萬以上，占住院總患兒數量的30%。兒童重癥肺炎具有起病急、變化快、并發癥多等特點，如果搶救不及時或診治不當會使病情惡化，甚至造成患兒死亡。因此，對重癥肺炎患兒的及時和正確的診療一直是兒科的重點關注方向。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度達200 nt的非編碼RNA，近年來的研究發現，其在細胞生長、代謝及包括肺炎在內的多種人類疾病中起重要作用。lncRNA生長停滯特異性轉錄本5(lncRNA-GAS5)最初是從NIH3T3細胞中分離出來的，該基因已被發現可編碼一種與淋巴瘤相關的染色體位點。已有研究證明，lncRNA-GAS5通過miR-455-5p/SOCS3途徑促進肺炎患兒M1型巨噬細胞極化[3]。miR-451位于人類第11號染色體，是成熟紅細胞中表達量最高的miRNA，其表達量會隨紅細胞的分化而增加[4]。已有研究表明，miR-451缺乏會導致紅細胞發育障礙。另有證據顯示，miR-451在肺的炎癥性疾病的發生、發展過程中起重要作用，其異常表達可能成為診斷疾病的生物學標志物[5]。基于此，本研究擬探討lncRNA-GAS5與miR-451在重癥肺炎患兒中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年1月西北婦女兒童醫院收治的89例重癥肺炎患兒為研究組，其中男42例、女47例，平均年齡(4.13±1.34)歲。另選取同期在該院進行體檢的健康兒童92例作為對照組，其中男43例、女49例，平均年齡(4.37±1.46)歲。兩組性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)符合重癥肺炎的診斷標準[6]；(2)患兒臨床資料完整。排除標準：(1)有先天性心臟病、支氣管肺發育不良等先天疾病的患兒；(2)有家族性遺傳病的患兒；(3)既往有窒息病史的患兒；(4)合并有敗血癥等感染性疾病的患兒；(5)有意識障礙的患兒。本研究經西北婦女兒童醫院倫理委員會批準，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 所有受試者均于清晨空腹采集靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min，分離血清進行相關指標檢查或置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.2血清lncRNA-GAS5及miR-451水平的檢測 通過Trizol 試劑(Invitrogen，日本)提取血清中的總RNA，并用分光光度計(Thermo Fisher Science，美國)測定RNA的濃度。根據制造商說明書，用PrimeScript RT Master Mix試劑盒(Takara，日本)將總RNA反轉錄成cDNA。用Takara SYBR Green PCR試劑盒(Takara，日本)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)。反應體系(20.0 μL)：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，cDNA模板(20 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究以U6為對照，采用2-ΔΔCt計算lncRNA-GAS5及miR-451的相對表達水平。試驗所用引物序列如表1所示。

表1 試驗所用引物序列

1.2.3血清載脂蛋白E(ApoE)、C-反應蛋白(CRP)及血清降鈣素原(PCT)水平的檢測 采用博科BK-400及其配套試劑(山東濟南博科集團-博科生物有限公司)通過免疫比濁法檢測血清ApoE及CRP的水平；采用免疫分析儀及其配套試劑(法國生物梅里埃公司)通過化學發光法檢測血清PCT的水平。

2 結 果

2.1兩組受試者血清lncRNA-GAS5及miR-451的表達水平 與對照組相比，研究組血清lncRNA-GAS5的表達水平明顯降低，miR-451的表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者血清lncRNA-GAS5及miR-451的表達水平

2.2兩組受試者血清ApoE、CRP及PCT水平 與對照組相比，研究組血清ApoE、CRP及PCT的水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組受試者血清ApoE、CRP及PCT水平

2.3研究組患兒血清lncRNA-GAS5、miR-451與ApoE、CRP、PCT的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，血清lncRNA-GAS5表達水平與ApoE、CRP、PCT水平呈負相關(r=-0.493、-0.526、-0.477，P<0.05)；血清miR-451表達水平與ApoE、CRP、PCT水平呈正相關(r=0.547、0.446、0.454，P<0.05)。

2.4血清lncRNA-GAS5與miR-451對重癥肺炎的診斷價值 通過ROC曲線分析血清lncRNA-GAS5、miR-451及二者聯合診斷重癥肺炎的效能，結果發現，血清lncRNA-GAS5、miR-451及二者聯合檢測診斷重癥肺炎的曲線下面積(AUC)分別為0.869(95%CI：0.813～0.924)、0.966(95%CI：0.943～0.989)及0.979(95%CI：0.963～0.995)，聯合檢測的AUC大于單項檢測。見表4和圖1。

表4 血清lncRNA-GAS5及miR-451對重癥肺炎患兒的診斷價值

圖1 血清lncRNA-GAS5及miR-451診斷重癥肺炎的ROC曲線

3 討 論

肺炎雖然是一種在臨床上較為常見的疾病，但其卻具有潛在的危險性，若不能及時干預，有發展成重癥肺炎的風險，嚴重時會引起全身炎癥反應、多器官功能障礙、膿毒性休克，甚至威脅患者的生命安全。據統計，重癥肺炎患者病死率高于30%，若抗感染治療不及時，病死率將增加至60%[7]。因此，如何及時確診并降低該病的病死率，是目前研究的重點。

已有研究證明，lncRNA在生物體生長、發育過程中扮演重要角色，其可通過轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳學水平對靶基因的表達進行調控，參與多種疾病的發生、發展。近年來，lncRNA已成為多種疾病的重要診斷標志物。在肺炎方面，已有多項研究證明lncRNA可能是其關鍵的調控因子。CUI等[8]發現，lncRNA NEAT1可通過吸附miR-146b調節嬰兒肺炎。CHEN等[9]則證明，lncRNA NNT-AS1、CRP和PCT在肺炎患者中均高表達，且lncRNA NNT-AS1與CRP、PCT的表達呈正相關，共同促進肺炎的發生。lncRNA-GAS5已被證明在多發性骨髓瘤、宮頸癌等癌癥組織或血清中表達下調，并與患者預后相關[10-11]。WANG等[12]的研究證明，與健康人群相比，lncRNA-GAS5在肺炎患者血清中表達下調，其通過下調miR-155抑制脂多糖(LPS)誘導的人支氣管上皮細胞凋亡。在本研究中，與健康兒童相比，重癥肺炎患兒血清中lncRNA-GAS5表達明顯降低，這與WANG等[12]的研究結果一致。另外，本研究通過相關性分析還發現lncRNA-GAS5與ApoE、CRP、PCT的表達呈負相關。

miRNA作為長度約為22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，也在生物體中參與轉錄后基因表達調控。FEI等[13]的研究發現，在肺炎患兒中，miR-3941表達下調，其可通過靶向IGF2調節PI3K/AKT通路的激活，促進LPS誘導的A549細胞損傷。孫旦等[14]研究顯示，miR-492在支原體肺炎患兒血清中的水平較健康兒童明顯升高，這說明其可能參與支原體肺炎的炎癥反應。近年來的研究發現，miR-451可參與腫瘤、神經系統疾病及呼吸系統疾病的發生、發展[15-17]。有研究證明，miR-451 可能通過抑制Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB通路減緩哮喘氣道炎癥[18-19]。本研究發現，與健康兒童相比，重癥肺炎患兒血清中miR-451的表達明顯上調，且其與ApoE、PCT、CRP的表達呈正相關。

另外，本研究通過ROC曲線分析發現，lncRNA-GAS5診斷重癥肺炎的靈敏度、特異度分別為84.3%、87.9%，AUC為0.869；miR-451診斷重癥肺炎的靈敏度、特異度分別為93.3%、91.2%，AUC為0.966。這一結果說明單項檢測時miR-451對于重癥肺炎的診斷效能高于lncRNA-GAS5。對lncRNA-GAS5和miR-451進行聯合檢測，其靈敏度、特異度分別為86.1%、92.1%，AUC為0.979。這一結果說明二者聯合檢測診斷重癥肺炎時的診斷效能高于lncRNA-GAS5、miR-451單項檢測。

綜上所述，lncRNA-GAS5和miR-451均有可能成為重癥肺炎的早期診斷標志物，且二者聯合檢測的診斷效能高于單項檢測。但本研究是單中心、小樣本量研究，結果具有一定的局限性，因此還需要更大樣本量的研究來驗證上述結果。