四種不同食性魚類的消化酶活性及腸道組織形態學比較研究

榮 華，張 雷，王曉雯，武祥偉，王金浩，胡 青，畢保良，孔令富，豆騰飛

(1．襄陽職業技術學院，湖北襄陽 441050；2．云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；3．云南華衡檢測技術有限公司，昆明 650201)

食性是魚類在進化過程中，依其生存環境和餌料生物來源逐漸形成的食物偏好習性[1-2]。魚類食性以進食方式和食物內容劃分為植物食性、動物食性、雜食性及濾食性[3]。魚類的食性受到諸多因素的影響，不僅與內在遺傳和生理因素如食欲、攝食器官、消化道結構、消化酶活性有關，還與外在的餌料生物、環境及消化道微生物等有關[4]。許多魚類從幼魚生長至成魚，都會發生一定的食性轉變，如草魚幼魚期食性經歷三個階段：浮游動物食性階段、食性轉變階段和草食性階段[5]，諸多因素的存在增加了魚類食性界定難度。而判定魚類食性是研究魚類營養學的基礎，對研制魚類飼料和科學投喂具有重要意義。

魚類食性與其腸道消化酶活性密切相關，如HIDALGO等[6]研究發現鰻鱺(Anguillajaponica) 的淀粉酶活性比虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的高；草食性和雜食性魚類的淀粉酶活性要高于肉食性魚類[7]。魚類的食性也與消化器官的發育及機能、腸道微生物的群落結構密切相關[8-9]。本實驗選取草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鱖(Sinipercachuatsi)、滇池高背鯽(Carassiusauratus)、昆明裂腹魚(Shizothoraxgrahami)分別作為草食、肉食、雜食和濾食性魚類代表，通過分析魚類食性與腸道結構和消化酶活性的關系，評價不同食性魚類對各類營養物質的消化利用潛力，為合理配置飼料、科學投喂提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及樣品采集

本實驗所采用的草魚(1 323.6±40.20) g、鱖(841.3±34.54) g、滇池高背鯽(350.4±25.98) g、昆明裂腹魚(471.1±23.94) g,均捕撈于云南滇池及附近水域，并運至云南農業大學水產養殖實驗室暫養，所有魚在水泥池暫養12 d，期間投喂實驗室自備暫養飼料，飼料配方見表1，每種魚隨機選擇10尾，將新鮮活魚經麻醉劑(40 mg/L丁香酚)浸泡后，每個品種隨機挑選3尾魚存于4 ℃冰箱中，用于后續體成分分析；再隨機挑選3尾魚用于血液樣本的采集，利用尾靜脈采血法抽取血液后，靜置低溫離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，分離取上層淡黃色液體即為血清，分離的血清樣品置于-20 ℃冰箱中保存，直至后續檢測；最后選取3尾魚進行解剖，取肝胰腺及腸道組織樣品，保存于-20 ℃冰箱用于消化道酶活測定；剩下的1尾魚，解剖取小腸用于組織切片觀察，盡量剔除小腸外壁脂肪，取出前腸(幽門盲囊后0.5 cm處)，分成小塊(1cm×1cm)固定于Bouin′s(波恩氏)液中。

表1 實驗飼料配方和營養組成(干物質基礎)

2)維生素預混劑(mg/kg)：維生素A，12；維生素B12，0.1；維生素C，150；維生素D3，5，維生素E，80；維生素K3，10；肌醇，80；泛酸，30；煙酸，100；葉酸，12；生物素，0.8；乙氧喹，80。

1.2 近似成分分析

全魚干物質、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量依照Association of Official Analytical Chemists(AOAC，1995)建立的方法進行測定[10]。簡要敘述如下：水分在干燥后用重量法測定，樣品置于烘箱(FUMA DGX-8053B，上海)中105 ℃烘至恒重；粗蛋白利用凱氏定氮法測定，使用凱氏定氮自動取樣系統1035分析儀(Hoganas，Sweden)測定蛋白(N=6.25)；采用脂肪提取系統SZF-06A(上海新家儀器有限公司)，用石油醚萃取法測定粗脂肪含量。粗灰分利用燃燒法測定，將樣品置于馬弗爐(Carbolite CWF 11/5，Hope Valley，UK)內550 ℃燃燒12 h以上，直至燃燒完全成白色粉末。

1.3 血液生化指標測定

本實驗涉及的所有血清生化指標，包括谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(AIB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CH)和總蛋白(TP)，使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒(試劑盒貨號分別為：C010-2、C009-2、A028-2、C009-2、A110-1、A110-1、A045-4)，參考說明書依步驟對樣品進行前處理，然后在全波段掃描酶標儀(Tecon，Australia)上測定吸光度(OD值)，根據標準曲線或計算公式得到各指標的濃度。

1.4 消化酶活性測定

實驗魚肝胰腺及腸道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及粗酶液中的總蛋白的測定使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒(試劑盒貨號分別為：A080-2、A054-1、C016-2、A045-2)，參考說明書依步驟對樣品進行前處理，然后在紫外分光光度計UV-5200(上海元儀器有限公司，中國)上測定蛋白酶樣品的吸光度(OD值)，在可見分光光度計V-5000H(上海元儀器有限公司，中國)上測定脂肪酶和淀粉酶。檢測樣品反應液的顏色深淺與樣品中消化酶活性呈正相關。根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線和回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。利用試劑盒說明書用考馬斯亮藍法測定粗酶液中的總蛋白濃度。

1.5 腸道組織形態

經過波恩氏液固定后的腸道樣品依次通過脫水—透明—浸蠟—包埋—切片—烤干等步驟，制成組織切片，然后經過HE染色，主要用蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質，最后脫水封片，利用電子生物顯微鏡KOPPACE 40X-1600X(科普艾斯科技有限公司，深圳)觀察，染色后細胞核呈現藍色，細胞質紅色。利用Case Viewer 軟件對前腸組織褶皺高度、褶皺寬度和肌層厚度分別進行測定。

1.6 數據分析

利用分析軟件SPSS 20.0進行數據統計，實驗數據以均數±標準差表示；利用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗食性操縱的主效應，通過Tukey多重比較確定各實驗組間的差異顯著水平，P<0.05為差異顯著；用Origin 75 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 四種不同食性魚類體近似成分比較分析

本實驗分析計算出草魚、昆明裂腹魚、鱖和滇池高背鯽四種魚的體近似成分(表2)。結果顯示，肉食性鱖魚體水分含量最低，而蛋白含量最高，并達到顯著水平；濾食性昆明裂腹魚魚體粗脂肪含量要顯著高于其他三種魚類，而灰分含量顯著低于其他三種魚類；雜食性滇池高背鯽魚體粗蛋白和粗脂肪含量最低，而水分和灰分含量最高。總的來說，魚體近似成分受到魚類品種(食性)的顯著影響。

表2 四種魚類的近似成分比較分析

2.2 四種不同食性魚類血液生化指標比較分析

血液生化指標是反映機體代謝水平和健康狀況的內在“指示劑”，本研究測定分析了四種魚類血液生化指標的差異。如表3所示，血液生化指標中GOT、AIB、TG、TCH受品種(食性)的影響顯著。其中，肉食性鱖的GOT、TG、TCH顯著高于其他三種魚類；草食性魚類AIB最高，顯著高于其他三種魚類。另外，血液中GPT、ALP、TP水平較為穩定，基本不受品種(食性)的影響。

表3 四種魚類的部分血液生化參數比較分析

2.3 四種不同食性魚類消化酶比較分析

由圖1可見，鱖的胰蛋白酶和胰脂肪酶活性最高，鱖的胰淀粉酶活性最低，顯著高于(低于)其他三種魚。草魚與滇池高背鯽的胰蛋白酶和胰脂肪酶活性顯著低于鱖和昆明裂腹魚，而草魚和昆明裂腹魚胰淀粉酶活性顯著高于鱖和滇池高背鯽。由圖2可見，鱖的腸蛋白酶活性最高，腸淀粉酶活性最低，顯著高于(低于)其他三種魚類。昆明裂腹魚腸脂肪酶活性最低，顯著低于其他三種魚類。草魚和滇池高背鯽的腸脂肪酶和腸淀粉酶顯著高于昆明裂腹魚和鱖。

圖1 四種魚類肝胰腺消化酶活性

2.4 四種不同食性魚類腸道形態學比較分析

四種魚類腸道組織形態學觀察見圖3和表4，由圖3可知，四種魚的絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度均存在顯著差異。考慮到四種魚的體型、體重存在較大差異，我們利用絨毛高度指數、絨毛寬度指數和肌層厚度指數削弱體重對腸道形態的影響(表4)，結果表明：絨毛高度指數、絨毛寬度指數和肌層厚度指數在四種魚之間仍然差異顯著，具體表現為絨毛高度指數：草魚>鱖>昆明裂腹魚>滇池高背鯽魚；絨毛寬度指數和肌層厚度指數：鱖>草魚>滇池高背鯽魚>昆明裂腹魚。另外，由圖3可見，四種魚腸道形態各具特點，差異較大。如鱖腸道微絨毛分支較多，結構復雜，如按微絨毛復雜程度排序可為：鱖>草魚>昆明裂腹魚>滇池高背鯽魚。

表4 四種魚類的腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的比較分析

圖3 四種魚類腸道組織形態

3 討論

魚類的食性直接影響其食物組成，而通過分析食物組成也成為判定魚類食性最直接有效的方法[11]。魚體組織中的近似成分分析直接反映了其餌料組成[12]，因此對魚類食性的判定具有一定的輔助作用。目前關于昆明裂腹魚的研究相對較少，對其食性一直沒有準確的判定。李國治等[13]報道魚體大小及發育階段對昆明裂腹魚食性影響較大，如在幼魚和稚魚期以浮游動物為主，其食性為雜食偏動物食性，而成魚階段屬于雜食偏植物食性，主要以浮游植物和藻類為主，特別是裂腹魚下顎前緣有銳利的角質，利于舔刮石塊上固著的藻類。本研究發現鱖中粗蛋白含量顯著高于其他三種魚類，這也間接印證了鱖的食肉特性。而昆明裂腹魚和滇池高背鯽中粗蛋白含量介于草魚和鱖之間，間接判定昆明裂腹魚和滇池高背鯽屬于雜食性魚類。另外，昆明裂腹魚食性受季節和環境中餌料生物的組成影響也較大，諸多因素都導致明裂腹魚食性比較復雜，較難鑒定，需要結合更多的實驗結果綜合分析[14-15]。血液生化參數是反映動物機體新陳代謝及其健康狀況的重要指標，也是動物對營養吸收利用最直接的指示[16-17]，還是不同食性魚類利用營養物質潛力的間接反映。本研究對四種魚類血液生化指標進行了比較分析，發現血液生化指標中GOT、AIB、TG、TCH受到品種(食性)的顯著影響。GOT在機體蛋白質代謝中起重要作用，測定血清GOT活性可以反映機體蛋白質代謝水平和肝細胞的功能狀況[17]。本研究發現血清GOT活性在四種魚中從高到低依次為：鱖、滇池高背鯽、昆明裂腹魚、草魚。TG由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，又稱中性脂肪，在體內主要起供能作用；血清TCH包含血液所有的游離膽固醇和膽固醇酯，血清TG和TCH是脂代謝的重要指標[18]。本研究中鱖血清TG和TCH均顯著高于其他三種魚，昆明裂腹魚和滇池高背鯽依次介于其中，而草魚血清中TG和TCH含量最低，表明鱖脂質代謝水平最旺盛，而草魚相對較弱。綜上表明血液生化指標與魚類食性相適應，如鱖屬肉食性特性，草魚植物食性，所以鱖脂質代謝較草魚旺盛。血液生化指標雖然能反映魚類營養吸收及生理狀況，對魚類食性的鑒定具有很好的輔助作用，但血液生化指標會受到諸多因素的影響，如環境，應激，性別及魚類發育階段等[19-20]，因此還需要借助一些更有效、更直接的手段幫助鑒定魚類食性。

魚類的食性是與其消化器官的組織結構和消化機能相適應的，如潘黔生等[21]對6種有胃真骨魚類消化系統進行了比較解剖研究，口裂大小、咽齒的發達與否，胃的存在與否以及腸道的長短等均與食性有密切的關系。鱖是有胃魚的代表，草魚和滇池高背鯽屬于典型的無胃魚，昆明裂腹魚食道與腸道之間有一個膨大狀的囊腔，具有分泌消化液，行使胃的部分功能。魚類食性與消化酶活性也是有一定相關性的，食性不同，消化器官組織結構，其消化機能明顯不一樣，導致消化酶活性也有明顯差異[22-23]。如不同食性魚類對飼料中碳水化合物的利用不用，雜食性魚類較肉食性魚類可利用更高水平的碳水化合物[24]。本研究發現胰蛋白酶、腸蛋白酶和胰脂肪酶活性大致表現為肉食性>雜食性>草食性。一些學者也報道了相似結果，劉運正等[25]報道蛋白酶活性與食性有關，肉食性魚類的蛋白酶活性顯著高于雜食性和草食性。PARRIZAS等[26]指出，一般肉食性魚類的脂肪酶活性要高于草食性和雜食性魚類。本實驗中草魚和滇池高背鯽的腸脂肪酶活性高于鱖和昆明裂腹魚，可能因為前者屬于無胃魚，因此腸道需要行使部分胃的功能，所以導致腸脂肪酶活性較高。李向松等[27]比較了草魚、異育銀鯽和青魚淀粉酶的差異后指出，草食性草魚和肉食性青魚對玉米淀粉的利用要優于雜食性異育銀鯽。劉泓宇等[28]報道了雜食性魚類的淀粉酶活性要高于肉食性魚類。本研究也發現了相同的結果，草魚的胰淀粉酶和腸淀粉酶活性最高，而鱖的最低。另外，腸道是魚類機體營養物質消化和吸收的主要器官，特別是對一些無胃魚，其消化作用更加突出。不同食性魚類腸道各部形態結構上各具特點，如肉食性魚類腸道較短，雜食性魚類腸道較長，草食性魚類介于之間[23]。劉懷如等[29]對南方胡子鲇的消化系統進行解剖觀測，其消化系統的形態結構表現出與食性相適應的特點。本研究也發現四種食性魚類腸道組織形態各異，腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度在四種魚類之間均存在顯著差異。鱖腸道微絨毛分支較多，結構復雜，按微絨毛復雜程度(絨毛長度和絨毛寬度)排序可為：肉食性>草食性>雜食性。肌層厚度也與腸道微絨毛復雜程度一致，肉食性>草食性>雜食性。腸道的特殊結構決定了腸道是魚體容納食物、運輸食物以及消化吸收營養物質的主要場所，腸微絨毛高度、寬度及其復雜程度直接影響腸道的容納性及對營養物質的吸收[30]。腸道壁肌肉層由平滑肌組成，通過節律性舒張和收縮來推動食物在腸道內移動，肌層厚度直接反映腸道的收縮蠕動能力，加強腸道收縮蠕動是增加食物消化和降低食糜流通的有效手段[31]。肉食性魚類腸道較短，通過增加腸道結構的復雜性，可以降低食糜的流通速度，增強營養物質的吸收。因此，腸道結構的復雜性與腸道長度呈現相反的結果，并與魚類食性相適應，達到對營養物質充分吸收的目的。

綜上所述，魚體組成、血液生化指標、腸道形態結構及消化道酶活受食性的顯著影響，且各指標與魚類食性相適應。如肉食性魚類腸道雖短，但其形態結構較復雜，且其蛋白酶、脂肪酶活性相對較高，草食性魚類剛好相反，分析這些規律對魚類的食性鑒定具有很好的輔助作用。與畜禽相比，魚類的機械消化能力很差，特別是一部分無胃魚，消化功能的強弱很大程度上取決于消化酶活性。因此，研究魚類不同食性及其獨特的消化生理，根據魚類食性特點合理配制飼料，對提高飼料利用促進魚類生長具有重要意義。