飼料添加牛至精油對異育銀鯽生長、消化酶活性、腸道組織結構及血液生化指標的影響

王俊維，丁 旺，陳 凱，謝 駿，秦 婷，潘良坤，習丙文

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)生長速度快、個體規格大、易養殖，是重要的大宗淡水養殖品種，目前已經在江蘇、山東以及湖北等地大面積推廣養殖。近年來隨著養殖環境的惡化，異育銀鯽養殖病害問題多發，如大紅鰓病、孢子蟲病、鰓出血病[1-3]等，給異育銀鯽養殖業帶來了巨大壓力。腸道是魚類最大的免疫器官之一，其發揮著多種作用，例如對營養物質進行消化和吸收、抵抗病原微生物和食物抗原對機體的影響等[4]。因此，如何通過飼料途徑維護養殖魚體生理健康、增強魚體抗病力已引起產業廣泛關注。

與傳統添加劑相比，中草藥及其天然產物易被吸收且無殘留、無污染，是一種綠色高效的水產飼料添加劑。已有研究表明，飼料中添加中草藥及其提取物能夠促進水產動物生長，改善水產動物消化酶活性，提高抗氧化、抗炎和抗病能力[5]。天然牛至精油是從中草藥牛至中提取出的一種揮發性精油，其多以香芹酚(香荊芹酚)、百里香酚、γ-萜品烯和p-異丙基甲苯等為主要成分[6]。牛至精油在水產養殖中在抗菌[7-8]、抗氧化[9]、免疫促進[10]、促生長[11]、抗寄生蟲[12]等方面具有廣泛的應用。ABDEL-LATIF等[13]研究表明，添加牛至精油可以改善鯉(Cyprinuscarpio)的腸道組織形態，保護肝臟功能，提高生長性能指標和飼料利用參數。因此，為減少抗生素使用量，保障養殖品安全，在養殖過程中使用中草藥來改善腸道健康已逐漸得到廣泛關注并成為研究熱點。

本研究以異育銀鯽為對象，在基礎飼料中添加不同劑量的牛至精油，探討其對異育銀鯽生長、消化酶、腸道組織結構、肝臟的影響，以期為牛至精油在水產養殖中的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和設計

實驗用異育銀鯽苗種由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心試驗基地提供。牛至精油(98%)購自上海源葉生物科技有限公司。以基礎飼料為空白對照組飼料，向基礎飼料中添加不同含量的牛至精油制作6組飼料，添加量分別為0(空白對照)、25、50、100、200、400和800 mg/kg，基礎飼料組成與營養水平如表1。

表1 基礎飼料組成與營養水平(風干基礎)

1.2 飼養管理

實驗開始前將異育銀鯽放入池塘網箱暫養，用基礎飼料馴化2周后，經24 h饑餓處理后，選擇規格、體質量[(37.18±0.26) g]基本一致的健康異育銀鯽630尾。實驗設計分為7組，每組90尾，每個組3個重復，每個重復30尾，養殖于室外2×666.7 m2池塘網箱。

投飼量為魚體質量的2%～4%，每天投喂3次。實驗期間水溫25～32 ℃，pH 6.8～7.5，溶氧5～8 mg/L，氨氮<0.01 mg/L，硫化氫<0.1 mg/L。每隔2周根據魚體質量適當調整投飼量，每日記錄循環養殖池塘的水溫及溶氧，觀察異育銀鯽的生長狀態，并記錄死亡情況，實驗周期為8周。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 樣品采集

飼養結束后，停食24 h，對每個網箱中魚進行稱重和計數；每個網箱隨機挑選10尾魚用20 mg/L的MS-222麻醉處理后測量其體重、體長；用抗凝劑潤洗的2 mL無菌注射器取尾靜脈血，隨即轉入抗凝管中，離心收集上清液(4 ℃，2 500 r/min，10 min)，分裝后-20 ℃保存備用；解剖剪取前腸用預冷生理鹽水快速沖洗后用紙吸干水分，置于自封袋中-80 ℃冰箱保存備用；剪取后腸轉移至4%的多聚甲醛固定液中固定備用。

1.3.2 生長指標測定

計算特定生長率(SGR)、增重率(WGR)、餌料系數(FCR)、肥滿度(CF)和存活率(SR)，計算公式如下：

WGR=(Wt-W0)×100%/W0

SGR=[(lnWt-nW0)/t]×100%

FCR=Wf/(Wt-W0)

CF=Wt(g)/[L(cm)]3×100

SR=Nt/N0×100%

式中：Wt為魚體末質量(g)，W0為魚體初始質量(g)，t為實驗天數，Wf為投喂飼料總質量(g)，L為魚體體長(cm)，Nt為終末尾數，N0為初始尾數。

1.3.3 腸道消化酶活測定

前腸組織用0.85%的生理鹽水進行組織勻漿，于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定消化酶活性。采用福林-酚法測定胰蛋白酶活性，采用甲基試鹵靈底物法測定脂肪酶活性，采用碘-淀粉比色法測定α-淀粉酶活性，具體操作按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。胰蛋白酶以37 ℃條件下，每分鐘水解干酪素生成1 μg酪氨酸作為1個活性單位；α-淀粉酶以37 ℃條件下，每毫克組織與底物作用30 min，水解1 mg淀粉為1個活性單位；脂肪酶以37 ℃條件下，每毫克組織在反應體系中與底物反應1 min消耗1 μmol底物為1個活性單位。

1.3.4 腸道組織形態檢查

取出固定過夜的后腸組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，切片，37 ℃過夜烘干。蘇木精-伊紅(HE)染色后于光學顯微鏡下觀察腸道組織結構，測定腸壁厚度、腸絨毛長度、腸絨毛寬度、杯狀細胞數量。

1.3.5 血液生化指標檢測

總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、總膽紅素(TBIL)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)等相關指標使用全自動生化分析儀BS-400-2080檢測。

1.4 數據分析

實驗結果用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較，統計檢驗P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 飼料添加牛至精油對異育銀鯽生長性能的影響

如表2所示，8周實驗結束后，不同牛至精油飼料對異育銀鯽SR沒有顯著影響。隨著飼料中牛至精油添加量的增加，實驗組的末均重、WGR、CP和SGR均呈上升趨勢，且400和800 mg/kg組的末均重、WGR、CF和SGR均顯著高于空白對照組。另外，800 mg/kg組的WGR、CF和SGR顯著高于25和50 mg/kg牛至精油組。盡管室外網箱養殖實驗受到養殖期間的夏季高溫影響較大，造成WGR偏低和FCR普遍較高，但FCR隨著牛至精油添加量的增加呈下降趨勢，200、400和800 mg/kg組的FCR顯著低于空白對照組。各實驗組間FCR不存在顯著性差異。

表2 飼料添加牛至精油對異育銀鯽生長性能的影響

2.2 飼料添加牛至精油對異育銀鯽消化酶活性的影響

由表3可知，隨著飼料中牛至精油添加量的增加，胰蛋白酶活性呈上升趨勢，且200、400和800 mg/kg組顯著高于空白對照組。α-淀粉酶與脂肪酶活性隨飼料牛至精油水平升高呈先升高再降低趨勢，且均在牛至精油水平為200 mg/kg時達到最大值，并顯著高于0、25和800 mg/kg組，與100和400 mg/kg組無顯著差異。

表3 飼料添加牛至精油對異育銀鯽消化酶活性的影響

2.3 飼料添加牛至精油對異育銀鯽腸道組織結構的影響

飼料添加牛至精油對異育銀鯽腸道結構的影響如表4和圖1所示。與空白對照組相比，200、400和800 mg/kg組魚體后腸的腸絨毛高度、絨毛寬度和腸壁厚度均顯著性增加。800 mg/kg組魚體后腸的腸絨毛高度和絨毛寬度顯著高于50和200 mg/kg組，與400 mg/kg組無顯著差異。與空白對照組相比，50和800 mg/kg組魚體后腸的杯狀細胞數量差異不顯著，200和400 mg/kg組杯狀細胞數量顯著升高。

圖1 異育銀鯽后腸組織切片

表4 飼料添加牛至精油對異育銀鯽后腸組織結構的影響

2.4 飼料添加牛至精油對異育銀鯽血液生化指標的影響

由表5可知，TC、TBIL、TG和ALT在各實驗組間差異不顯著；AST活性隨飼料牛至精油水平的增加而呈現下降趨勢，且50、100、200、400和800 mg/kg組血液中AST含量均顯著低于空白對照組，而各實驗組之間差異不顯著。

表5 飼料添加牛至精油對異育銀鯽血液生化指標的影響

3 討論

3.1 不同牛至精油添加量對異育銀鯽生長性能的影響

目前，國內外相關研究發現飼料添加植物精油可以提高水產養殖動物的生產性能[14]。其中，牛至精油可以從多個方面促進養殖動物的生長，包括提高動物食欲、補充和完善餌料的營養水平、保持腸道菌群平衡、增強腸道上皮細胞對病原微生物的抵抗能力等[8,15]。本研究結果表明，飼料中添加牛至精油能夠改善異育銀鯽的生長性能。這可能歸因于牛至精油及其組分作用的影響。牛至精油本身具有獨特的香味，可以提高魚體的進食欲望，從而提高飼料的攝入量和食物的適口性，改善魚體的FBW和WGR[16]。生長性能改善的另一個可能原因是香芹酚和百里香酚的影響，它們可能刺激消化酶的分泌和酶的活性，從而促進營養物質的消化和吸收[11,17]。WALEED等[18]研究發現在低或中等養殖密度條件下，飼料中添加1 mL/kg的牛至精油能夠明顯改善尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的WGR、SGR和FCR。此外，DINARDO等[19]研究發現投喂添加含100 mg/L牛至精油的飼料后，歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)的最終體重、增重和比生長率與對照組相比均有顯著的正向影響，與本實驗結果相似。

3.2 不同牛至精油添加量對異育銀鯽消化酶活性的影響

胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等是魚體重要的消化酶組分[20]。腸道消化酶活性對飼料消化、吸收、利用均有重要影響[21]。本研究發現，與對照組相比，添加200、400和800 mg/kg牛至精油顯著提高異育銀鯽的脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶活性，從而促進異育銀鯽腸道消化吸收且中劑量添加效果更優。飼料中添加植物精油顯著提高了消化酶活性，其機理可能是魚體攝食精油后可刺激膽汁、消化道酶液分泌，提高消化酶活性，從而提高魚體對營養的消化吸收能力[22]。ZHANG等[10]研究表明，日糧中添加牛至精油可通過增加蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性水平來促進鯉的消化功能；同樣，植物精油在尼羅羅非魚[23]和海鯛(Sparusaurata)[24]上也有相同發現。因此，本研究認為在基礎飼料中添加牛至精油能夠顯著提高異育銀鯽腸道消化酶活性以及飼料消化、吸收、利用效率，進而促進異育銀鯽的生長。

3.3 不同牛至精油添加量對異育銀鯽腸道組織結構的影響

腸道是機體消化、營養物質吸收的重要場所，機體的消化功能與腸道發育密切相關[25]。腸道絨毛形態被認為是影響水生動物吸收能力的標志[26]。腸壁厚度的增加能夠增加腸道的柔韌性、促進食物移動，進而促進腸道內營養物質的消化吸收[27]。本研究中，與對照組相比，添加200、400和800 mg/kg牛至精油顯著增加魚體后腸的腸絨毛長度、寬度和腸壁厚度。添加牛至精油的飼料通過增加腸壁厚度、腸道絨毛長度和腸道絨毛寬度來增加吸收表面積，從而改善魚類腸道對營養物質的吸收。有研究發現從植物中提取的其他精油被證明也能增加尼羅羅非魚[28]以及非洲鯰(Clariasgariepinus)[29]的腸絨毛長度。ASMAA等[30]的研究表明，在尼羅羅非魚日糧中添加百里香酚后，其小腸絨毛長度顯著增加。ABDEL-LATIF等[13]研究發現日糧中添加牛至精油可以顯著增加腸絨毛長度和腸絨毛寬度，進而提高鯉對營養物質的吸收及消化食物的能力。牛至精油對腸道形態的改善與牛至精油的抗氧化性、抗菌性等有關[31]。有研究報道表明，牛至精油能夠促進腸道有益菌如乳酸菌和雙歧桿菌的生長，降低有害菌和條件致病菌的數量，減少其對腸道黏膜的損傷及用于細胞周轉的能量消耗[32]。

3.4 不同牛至精油添加量對異育銀鯽血液指標的影響

肝臟是機體膽固醇合成的主要場所，同時肝臟也有維持血液中膽固醇含量穩定的作用[33]；血液中膽固醇的含量能夠在一定程度上反映機體肝臟的健康程度，當機體肝臟損傷時血液中膽固醇的含量往往會升高。甘油三脂同樣是動物體內一種重要成分，機體能量増加通常伴隨著甘油三脂含量的增加，一般情況下，膽固醇升降往往伴隨甘油三脂升降[34]。此外，膽紅素屬于膽汁色素，總膽紅素是直接膽紅素與間接膽紅素的總稱[35]。肝細胞具有攝取膽紅素的能力，能夠清除血液中過多的膽紅素，若機體內的膽紅素超過了肝細胞的處理能力，血液中總膽紅素含量便會隨之升高[36]。低溫脅迫會造成荷那龍羅非魚(Oreochromishornorum)的總膽紅素濃度上升，肝臟處理膽紅素能力明顯降低并產生代謝障礙[35]。本研究結果發現飼料添加牛至精油對異育銀鯽血液膽固醇、甘油三酯和總膽紅素影響不顯著，表明當前添加牛至精油劑量不會對異育銀鯽肝臟造成損傷。

AST和ALT是細胞線粒體中重要的氨基轉移酶，廣泛存在于魚類的心臟、腎臟、肝臟、鰓等組織中[37-38]。正常情況下谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶主要存在于肝細胞的線粒體中，血液中二者含量較少；而組織受損或者功能減弱時，細胞膜滲透增大，致使血液中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶升高[39]。因此，血液中AST和ALT的含量可以作為評價魚類肝臟損傷程度重要指標。SEYYED等[40]研究發現百里香酚能夠顯著降低虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血液中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶含量，還能夠降低血糖含量，減少對肝臟功能的損傷。ABDEL-LATIF等[13]報道，鯉飼料中添加牛至精油對肝功能酶沒有顯著影響，表明魚類飼料中添加牛至精油對它們的肝組織沒有毒性作用。本實驗中，飼料中添加牛至精油能夠顯著降低血清AST含量，表明牛至精油可在一定程度內保護肝臟。

4 結論

本實驗研究結果表明，飼料添加牛至精油對異育銀鯽生長性能、腸道酶活、腸道組織結構和肝臟保護能力有明顯影響。綜合異育銀鯽生長性能、腸道組織結構及消化酶活性和血清生化指標，建議飼料牛至精油添加量為100～400 mg/kg。