利用流式細胞術鑒定樺木染色體倍性和DNA 含量

黃茂根 沈 凝 劉雪羽 吳興盛 陳愛平 孟 巖 胡現鉻 童再康 黃華宏 樓雄珍

（1. 羅卜巖自然保護區管理站，福建 三明 365050；2. 浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 臨安 311300；3. 官莊國有林場，福建 三明 365050；4. 信陽市林業科學研究所，河南 信陽 464000）

如何有效評估植物基因組大小是開展植物遺傳改良和分子遺傳學研究的關鍵問題之一。目前，鑒定植物基因組大小的主要方法有流式細胞術（FCM）、Feulgen 光密度測定法（FDM）和全基因組測序法（WGS）[1]，其中FCM 操作簡單、檢測結果準確、檢測成本低，是最常用的測定方法。例如，通過對山茶屬和山茶亞屬株的DNA 含量進行測定，識別出普洱茶（Camellia sinensisvar.assamica）的基因組大小[2]；通過對藍莓（Vacciniumspp.）個體的測定，發現其倍性豐富，包含從2 倍體到6 倍體等不同的種[3]；通過對香蕉（Musa nana）的倍性檢測，發現其至少含2 倍體、3 倍體和4 倍體[4]。物種基因組大小的預估，可以提前預測解析其基因組所需要的成本，為后續的測序組裝等分析提供重要的理論參考，同時也為遺傳學和基因組學研究奠定基礎。

樺木屬（Betula）的適宜生態位主要分布于北半球亞熱帶、溫帶以及寒溫帶地區，約有100 個種[5]，我國自然分布約31 個種和6 個變種[6]，分布于我國的橫斷山區、四川盆地、滇南和新疆等地[7]。樺木屬植物包含很多重要的用材樹種，例如光皮樺（Betula luminifera）木材被我國列為一類木材，生長快、抗性強，具有很高的經濟價值和廣闊的開發前景。樺木屬植物倍性豐富，從2 倍體到12 倍體不等，1C 值在0.44 pg（430 Mb）到2.67 pg（2 611 Mb）之間，2Cx 值在371 Mb 到616 Mb 之間[8]。當前，樺木屬植物的基因組信息還不豐富[9-10]，且缺乏針對樺木屬植物的基因組評估測定方法。因此，建立有效的評估體系對樺木屬植物的倍性進行鑒定，可快速鑒定樺木種間雜交后代的倍性，可為未來選育出適應性強，生長速度快，材質優良的樺木新品種提供重要的技術支撐。然而，目前國內對樺木屬植物的研究大部分集中在其基因功能解析，而對于樺木屬植物倍性與DNA 含量的研究相對較少，這也限制了我國樺木屬植物的研究和快速發展。本研究利用FCM 檢測不同種類樺木屬植物的細胞染色體的倍性，并針對不同材料、試劑先進行優選，篩選適合樺木屬植物的FCM 檢測體系，為未來的樺木屬植物的倍性育種和全基因組測序分析以及多倍體植物的形成機制探索提供研究基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料

7 種樺樹：河樺（Betula nigra）、光皮樺、光皮樺 × 河樺（Betula luminifera×Betula nigra）、垂枝樺（Betula pendula）、黑樺（Betula dahurica）、岳 樺（Betula ermanii）、堅 樺（Betula chinensis）均為浙江農林大學苗圃地所栽培。毛果楊（Populus trichocarpa）組培苗和光皮樺組培苗均為浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室組培室培養，其中毛果楊與垂枝樺為本實驗的對照。

1.1.2 儀器與試劑

流式細胞儀型號為CytoFLEX9（美國貝克曼庫爾特有限公司）；熒光染料為碘化丙啶（PI，SIGMA，美國）；RNaseA 購于天根生化科技（北京）有限公司；濾膜、鞘液等試劑均購于美國貝克曼庫爾特有限公司；0.22 μm 微孔濾膜購于密理博（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂解液與染料配制

實驗所需細胞核裂解液的配方見表1，除Otto II 常溫下保存，其余裂解液均使用0.22 μm微孔濾膜進行過濾后冷藏保存。為去除雙鏈RNA可能帶來的干擾，PI 染液中可以加入適量RNA酶。由于見光易分解，PI 染液配制和保存方法參照弓娜等[11]制定的FCM 在植物學研究中的應用方法，終濃度為50 μg/mL。

表1 細胞核裂解液配方Table 1 Formula of nuclear dissociation fluid

1.2.2 細胞核懸浮液制備

選取60 mg 植物新鮮葉片放入9 cm 的一次性培養皿中，加入1 mL 預冷的細胞裂解液與500 μL濃度為1% PVP 溶液，用鋒利的雙面刀片快速切碎。利用3 mL 塑料吸管將懸浮液吸取并通過500 目的濾膜將懸浮液過濾，濾液收集至2 mL 離心管中，冰上靜置5 min。1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入100 μL 預冷的裂解液重懸，再加入150 μL 預冷的含RNase 的PI 染液對細胞核進行熒光染色，4 ℃避光孵育5 min。用500 目的濾膜再過濾，移至上樣管，上機檢測，低速收集記錄10 000個顆粒。

1.3 葉片狀態與保存方式處理

葉片狀態分為3 種：嫩葉為2 個月的組培苗從上往下數第1 或2 片葉片，幼葉為野外1 a 生枝條從上往下數的第1 至2 片葉，成熟葉為野外1 a 生枝條上第5 片葉片。

當天采集幼葉的保存方式分為4 種：保存方式1，將其放入保鮮袋中常溫保存；保存方式2，將其放入保鮮袋中冷藏保存；保存方式3，放入含有1% PVP 的PE 管中常溫保存（3 h）；保存方式4，放入含有1% PVP 的PE 管中常溫保存24 h。

1.4 數據分析

1.4.1 倍性及DNA 含量計算

對已知DNA 含量的對照樣本進行測定，根據通過PI 染色的細胞核的相對熒光強度比值來計算出待測樣本的DNA 含量[12]，再通過已知倍性為2 倍體的垂枝樺的熒光強度來計算出未知樺木屬植物的DNA 倍性。

1.4.2 數據收集及分析

PI 熒光激發波長為488 nm，上機后收集通道585/42BP 的熒光，檢測PI 發射的熒光強度。變異系數（CV）值控制在5%以內。使用CyExpert軟件進行數據收集與分析。參照Huang 等[2]提供的計算公式計算樣本的1C 值。每個樣本檢測3 次，利用SPSS 22 軟件進行數據的顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 裂解液種類對檢測效果的比較

由于目前植物還沒有通用的細胞核裂解液，因此篩選出對該物種細胞核提取效果最佳的裂解液對于流式細胞檢測而言至關重要。本實驗利用光皮樺組培苗嫩葉為材料進行實驗，結果如圖1 所示，Galbraith's、GPB、LB01、Marie's 裂解液雜質多，均出現明顯雜質峰，其中Marie's 裂解液收集的有效細胞核數最少（不足160），通過散點圖發現顆粒分布并不集中，大部分為細胞雜質碎片，表明這些裂解液不能較好的提取細胞核。圖1c、i 中發現HEPES 與Tris-MgCl2裂解液所得直方圖雖看起來雜質干擾較少，但HEPES 裂解液的CV 值大于5%，結果不可信，Tris-MgCl2裂解液所得直方圖出現G1+ G2期峰，說明出現了細胞核黏連的情況。圖1h 發現OTTO 裂解液顯示G1期峰左右不對稱，對光皮樺而言不是最佳裂解液。圖1f、g 中mGb裂解液與MgSO4裂解液所得G1期峰左右對稱，G2期峰明顯，無雜峰干擾，mGb 裂解液提取速率為311 個/秒，MgSO4裂解液提取速率為485 個/秒，提取速率高，均可作為制備光皮樺組培苗單細胞懸浮液的裂解液。但MgSO4裂解液提取效果略高，因此，選擇MgSO4裂解液進行進一步實驗。

圖1 光皮樺樣品不同裂解液流式細胞分析直方圖Fig. 1 Histograms of Betula prepared from different nuclear dissociation solutions

2.2 葉片成熟度對檢測效果的影響

由圖2c 可知，由于成熟葉次生代謝旺盛，產生大量多糖多酚物質易被氧化，使提取液變得濃稠，無法通過500 目的濾膜，從而干擾MgSO4裂解液的提取效率，使得收集有效顆粒數極少，不到20 個，G1期峰出峰困難，雜峰明顯。圖2b 中幼葉G1期出峰明顯，G2期清晰，收集有效細胞核數比嫩葉稍低，結果清晰可靠。雖然嫩葉的直方圖最好，但由于外植體殺菌進行組培培養時間長，培養程序復雜，而幼葉來源簡單，采摘方便，更適合野外樣品的快速檢測，可替代嫩葉制備細胞核懸浮液進行流式檢測。

圖2 MgSO4 裂解液制備嫩葉、幼葉與成熟葉Fig. 2 The preparation of tender, young and old leaves with MgSO4 buffer

2.3 葉片保存方式對檢測效果的影響

由圖3a 可知，常溫保存的G1期峰明顯，雜峰干擾較大。由于常溫保存會使葉片中多糖多酚類物質氧化干擾裂解液提取細胞核而產生較大的雜質峰，CV 值為5.00%。圖3b 為冷藏保存， G1和G2 期峰明顯，雜峰較少，CV 值小于5.00%，這種保存方式較好，但野外采樣攜帶冰盒不便。由圖3c 可知，葉片放入1%PVP 液體中也可以減少葉片中多糖多酚物質氧化，從而使細胞核懸浮液檢測所得直方圖雜質峰較小，G1期峰左右對稱，G2期峰明顯，能得到冷藏保存的檢測效果，且細胞核提取量較高。由圖3d 可知，保存時間對提取效果影響巨大，G1期峰左邊出現明顯雜質峰，CV 值為6.84%，大于5%，一般情況下CV值在5%以下為可信，所以結果不可靠。野外采樣為了減少負重，增加樣品量將待測幼葉放入1%PVP 中浸泡常溫保存并及時上機檢測比較好。

圖3 不同保存方式對檢測效果的影響Fig. 3 The effect of different preservation methods on detection effect

2.4 樺木屬植物不同倍性間熒光強度比較

利用光皮樺篩選所得的流式細胞術體系檢測對其余樺木屬植物的適用性。由于對照樣本楊樹（Populussp.）與垂枝樺的基因組大小相近，所以采用外標法進行檢測。用已知基因組大小的毛果楊作為對照，檢測已知倍性和基因組大小的2 倍體樺木垂枝樺，初步確定對照與待測樣本的熒光強度范圍，設定檢測模板，在同一個模板下對其余6 個樺木屬植物進行倍性鑒定。PI 染液可以非特異性結合堿基，適用于基因組大小測定與倍性鑒定，為防止RNA 干擾加入RNaseA，此時的熒光強度可以代表DNA 相對含量[13]。因此，根據DNA 含量計算公式[1]可算出待測樣品DNA 含量。以毛果楊為參照估測其余樺木屬植物DNA含量，并以垂枝樺為對照估測其余樺木屬植物DNA 倍性。結合圖4 與表2 發現河樺與垂枝樺的DNA 倍性均為2 倍體，光皮樺 × 河樺DNA 倍性為3 倍體，光皮樺與岳樺的DNA 倍性為4 倍體，堅樺DNA 倍性為6 倍體，黑樺DNA倍性為8 倍體。光皮樺基因組為 (889.29 ± 48.94) Mb，河樺基因 組 大 小 為 (519.78 ± 12.18) Mb，光 皮 樺 × 河樺的DNA 含量在河樺與光皮樺之間，為 (670.66 ±21.81) Mb，估計為3 倍體，由此可證明光皮樺與河樺之間無生殖隔離，這可為未來的倍性育種提供新的依據。

表2 樺木屬DNA 含量及倍性估計Table 2 Ploidy and DNA content in Betula

圖4 樺木屬植物DNA 峰值圖Fig. 4 Flow histogram of Betula

分析結果顯示，垂枝樺基因組大小為 (471.94 ±34.68) Mb，這與Saloj 等[14]發表的垂枝樺基因組大小（440 Mb）非常相近。此外，岳樺、堅樺、黑樺的基因組大小分別為 (822.22 ± 68.79) Mb、(1 563.70 ± 85.50) Mb、(2 139.96 ± 41.56) Mb。同時，不同倍性樺木的DNA 含量差異顯著（P＜0.05），相同倍性樺木的DNA 含量差異不顯著（表2），由此可以推測樺木屬植物多倍體可能是由染色體加倍導致，基因組縮小現象也不明顯。為進一步研究樺木基因組大小演變，本研究還計算了1Cx值，其中方差分析發現1Cx 為0.42～0.55 pg，基本分為垂枝樺與河樺兩大類，黑樺單獨為一類，垂枝樺與光皮樺 × 河樺、岳樺、光皮樺、堅樺的1Cx 值差異均不顯著，與河樺、黑樺間1Cx 值差異顯著 （P＜0.05）；河樺與黑樺之間1Cx 值差異不顯著；堅樺與黑樺之間1Cx 值差異不顯著，黑樺與其余樺木1Cx 值差異均顯著（P＜0.05）。

3 結論與討論

FCM 檢測具有速度快、重復性好、檢測準確等優點，但準確度受植物組織、裂解液、葉片的成熟度和保存方式的影響較大。其中裂解液是FCM 檢測倍性實驗成功的關鍵，它決定了細胞核能否完整的被分離出來，細胞核能否被PI 染料染色。目前，還未發現植物的通用裂解液，因此需要篩選甚至優化裂解液來獲得最佳的細胞核懸浮液進行上機檢測。判斷本實驗結果可靠性的標準是CV 值[12]，CV 值越小，所得峰值結果越可靠，一般來說CV 值小于5%可視為可信。本實驗對9 種裂解液進行篩選，最終得出MgSO4裂解液提取效果最佳，CV 值控制在3%以內。FCM 方法鑒定倍性的實驗中，不同物種對應的最優裂解液也不同，如對槭屬植物解離效果均較好的是LB01 解 離 液[15]；Galbraith's 解 離 液 對 蓮 瓣 蘭（Cymbidium tortisepalum）和墨蘭（Cymbidium sinense）樣品解離效果最好[16]；同時，研究發現使用Galbraith's 解離液對金線蓮（Anoectochilus roxburghii）樣品的解離效果也較好[17]。樺木屬植物葉片含有豐富的多糖與多酚物質，易被氧化，提取時加入500 μL 體積濃度為1%PVP 和裂解液中的TritonX-100 可消除糖類、酚類雜質帶來的影響[18]，MgSO4裂解液含有穩定核染色體的Mg2+，KCl 可以維持植物細胞滲透壓，使細胞不易破碎，減少胞質中的多糖與多酚物質游離出來影響細胞核懸浮液的質量，DTT 的加入使染色質得到保護，進一步消除酚類物質對DNA 染色的影響[11]。選擇合適的材料與保存方式可提高FCM 的可行性，通常新鮮幼葉更加容易被檢測。葉片的生長狀態直接影響到制備的細胞核懸浮液能否用于檢測，一般情況下，老葉中的酚類次生代謝產物較多，易被氧化從而破壞細胞核的結構[19]，例如櫟屬植物老葉的細胞核提取產率就遠低于幼葉[20]。本研究得出樺木屬植物新鮮幼葉在1% PVP 溶液中浸泡常溫保存，用MgSO4裂解液制備細胞懸浮液進行檢測效果較好。

樺木屬植物的材質優良，經濟價值高[7]，部分種可作為觀賞樹種，且種間與種內變異豐富，是優良的林木遺傳研究材料。然而，樺木屬植物的基因組信息還不豐富[9-10]，目前在植物DNA C 值數據庫中僅包含5 個樺木樹種[16]。“1C 值”的概念由Greilhuber 等[21]于2005 年提出，代表一半體細胞DNA 的含量（2C），是統計植物基因組大小的有效指標。本研究發現不同倍性樺木DNA 含量存在顯著差異，1C 值在0.42～0.55 pg之間，與Wang 等[8]發現樺木屬植物從2 倍體到12 倍體的1C 值在0.42～0.57 pg 之間結果相似。此外，本研究結果中發現垂枝樺與光皮樺倍性不同，但它們之間1Cx 值差異不顯著，且堅樺與黑樺也屬于類似情況，這可能是由于植物體內多倍化水平由組織器官和發育階段差異造成。植物不同器官的多倍化水平不一致現象已經在蕓薹屬[22]、紫薇（Lagerstroemia indica）[23]，大麥（Hordeum vulgare）和小麥（Triticum aestivum）[24]等植物中被發現，但樺木屬植物中還缺乏類似的研究，未來需要更深入的研究。此外，基因組重復或加倍、DNA 丟失等均是造成基因組C 值差異的重要因素[19]，目前國內關于樺木屬植物C 值的測定還未展開，還需要更多的研究來分析樺木屬植物的基因組變化規律和主要影響因素。

對樺木植物倍性的鑒定中，本實驗所測得河樺為2 倍體，但河樺種內變異相對較大，種內存在2 倍體、3 倍體和4 倍體等不同倍性變種[25]。本實驗中垂枝樺基因組大小被鑒定為0.48 pg，這與Saloj 等[18]所測基因組0.45 pg 大小相近。光皮樺 × 河樺雜種的倍性為3 倍體，由此可知2 倍體河樺與4 倍體光皮樺間不存在生殖隔離，能通過雜交產生新的樺木種質。大部分情況下，3 倍體植物一般不育，生殖生長所需營養可供給營養生長，使木材的材性更加優良，因此，3 倍體林木的繁育更有利于材質的改良。FCM 鑒定出光皮樺 × 河樺子代倍性為3 倍體，可以為種間雜種鑒定提供一條新的研究道路。此外，FCM 在其他樺木樹種上也有成功的應用，如冰島的沼樺（Betula nana）被鑒定為2 倍體，西伯利亞銀色樺（B. pubescens）為4 倍體，沼樺 × 西伯利亞銀色 樺（B. nana×B. pubescens）為3 倍 體，平 均1C 值分別為448、666、882 Mb[26]，與本研究中的河樺、光皮樺、光皮樺 × 河樺所測結果相似，說明FCM 是鑒定樺木倍性的有效手段，且自然界廣泛存在著不同倍性樺木雜交以適應新的環境。相對于傳統的染色體計數法來確定植物的倍性，FCM 的研究方法相對簡單，工作量較小，對實驗室的條件要求也不高，但顯微鏡以及更先進的掃描電鏡對植物染色體進行觀察仍然是確定植物倍性最基本的方法，往往多種方法的結合運用才能更精確的鑒定植物倍性。

本研究發現，MgSO4裂解液是提取光皮樺細胞核的最佳裂解液，樺木屬植物幼葉次生代謝產物少，適合作為FCM 的檢測材料。研究結果分別揭示了垂枝樺、河樺、光皮樺 × 河樺、岳樺、光皮樺、堅樺、黑樺的DNA 倍性和含量，為樺木屬植物的基因組學研究、細胞生物學和種質資源研究提供了基礎數據。同時，有效的FCM 評估體系的建立，可快速鑒定樺木種間雜交后代的倍性，可為未來選育出適應性強，生長速度快，材質優良的樺木新品種提供重要的技術支撐。