比利時杜鵑與爆杖花雜交親和性研究

尹楊萍 關文靈 宋 杰 李葉芳 杜 娟

（1. 云南農業大學園林園藝學院，云南 昆明 650201；2. 云南省農業科學院花卉研究所，云南 昆明 650201）

比利時杜鵑（Rhododendron hybridum）又名西洋杜鵑，屬于杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）常綠灌木。因其株型矮壯、花大且花期長，受到了銷售市場的喜愛。但比利時杜鵑存在嚴重的退化現象，其適應性及抗病抗蟲能力較差[1]，在栽培后期易出現觀賞性不佳的情況。常綠灌木野生杜鵑爆杖花（Rhododendron spinuliferum）為杜鵑花屬，糙葉杜鵑亞屬（Subgen.Pseudorhodorastrum）植物，花色朱紅或橙紅，花形筒狀，觀賞性佳，具有作為雜交親本的潛能。

我國杜鵑花種質創新技術已較為成熟，但育種進程緩慢，對野生杜鵑資源的開發和利用還不足，在種質創新研究中應加大對我國豐富野生杜鵑資源的利用[2]。當前育種途徑還是以傳統雜交育種為主，通常采用遠緣雜交育種方法打破生殖隔離來培育觀賞性強、抗性高的新品種杜鵑。通過雜交親和性來判斷遠緣雜交是否成功，一般包括以下幾個指標：子房膨大情況、坐果率、單果種子數、授粉后花粉在柱頭的萌發情況、花粉管伸長及受精情況[3]。在前人研究中常綠杜鵑組亞組間雜交可達到高育性[4]，然而總體上杜鵑花種間雜交還是存在嚴重的受精前障礙，野生杜鵑存在雜交子房膨大率低的情況，不同亞屬間的杜鵑雜交后還存在嚴重受精前障礙[5]。雜交受精前障礙存在的現象一般包括：柱頭上花粉大量萌發，但會分泌出胼胝質來阻止花粉管伸入花柱，即使進入花柱后，花粉管也可能發生扭曲變形、頂端膨大和停止生長等現象，或者是花粉管過度生長等[6-7]。在目前的報道中有多種克服遠緣雜交受精前障礙的有效方法，其中一種是利用不同授粉方式進行雜交授粉，能夠打破雜交障礙，成功獲得雜種后代。國內外育種研究者發明了多種能夠有效克服遠緣雜交受精前障礙的授粉方式，如延遲授粉[8]、重復授粉[9]、切割柱頭授粉[10]等，Lee 等[11]的研究表明，正己烷處理和蒙導授粉是克服杜鵑花受精前障礙有效辦法。本研究對不同亞屬間的比利時杜鵑‘西瑪’和野生杜鵑爆杖花的雜交親和性進行綜合評價，并探討不同授粉方式對克服杜鵑雜交障礙的效應，研究成果有助于比利時杜鵑的遺傳改良，以培育出適應性更強，觀賞性更優的新品種杜鵑。

1 材料與方法

1.1 材料

母本為園藝品種比利時杜鵑‘西瑪’，栽植于云南農業大學園林園藝學院苗圃，植株生長健康，可正常開花。父本野生杜鵑爆杖花花粉采自云南省昆明市大哨村。

1.2 雜交前準備

在‘西瑪’和爆杖花盛花期時分別進行花柱長度的測量，得出父/母本花柱長度比為1.02，根據父/母本花柱長度比越接近1.0 則雜交越容易成功的理論判定此親本組合可進行雜交[12]。父本爆杖花朵采集后用針將花粉挑出，取部分新鮮花粉以MTT 染色法進行活力測定，得出花粉活力為71.44%，判定其可用于雜交授粉，剩余花粉放入硅膠干燥鍋里干燥48 h，后密封貯藏于-20 ℃冰箱里，待母本花期時進行雜交授粉。

1.3 授粉方式

2020 年1—4 月為比利時杜鵑‘西瑪’的盛花期，在此期間選取即將開放且已分泌粘液的花苞，去除雄蕊和花冠后即可用不同方式授粉，每日授粉時間為早上08: 00—11: 00，每種授粉方式下授粉50 朵。授粉后觀察并統計子房膨大數。待果實由綠轉黃后將果實采收并統計坐果數，剝出種子統計單果種子數。

授粉方式有：1）常規授粉：在柱頭上直接涂抹花粉；2）切割柱頭授粉：切去子房上部的柱頭和花柱，在傷口處涂抹花粉培養液（蔗糖50 g/L +H3BO3100 mg/L + Ca(NO3)2·4H2O 300 mg /L）；3）加熱花粉法：將花粉40 ℃恒溫處理1 h 后，再用于授粉；4）延遲授粉法：在去雄后套袋至第4 天進行授粉；5）重復授粉：以常規授粉方式連續授粉3 d；6）NAA 涂抹法：用0.1% NAA（萘乙酸）溶液涂抹柱頭后授粉。

1.4 花粉管的熒光觀察

取雜交授粉后8 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 的花柱及子房觀察，每個時段每種授粉方式采集至少3 朵花的雌蕊。雌蕊采取后盡快放入FAA 固定液中固定24 h，保存備用。隨后以70%乙醇—50%乙醇—30%乙醇—蒸餾水逐級漂洗3 次。壓片前，于60 ℃恒溫水浴中浸入8 mol/L NaOH 溶液中處理4 h，蒸餾水沖洗直至不再變色后用苯胺藍溶液染色24 h 后，雌蕊縱切展開滴加1～2 滴甘油壓片，在熒光顯微鏡下觀察，每張片子選取3 個視野拍照記錄。

1.5 雜交種子無菌萌發

將收獲的雜交種子在0.1%的GA3中浸泡24 h進行預處理，在超凈工作臺中以2.0%的NaClO滅菌20 min 后接種于1/4 WPM 培養基，放置于組織培養室進行培養觀察，30 d 后統計萌發數及綠苗數。

1.6 數據與指標體系等級劃分

各項指標計算方法為：

（1）子房膨大率（Or）=子房膨大數/授粉花朵數 × 100% ；（2）坐果率（St）=蒴果數/授粉花朵數 × 100%；（3）雜交種子萌發率（Gr）=萌發種子數/接種種子數 × 100%；（4）雜交種子綠苗率（Gs）=綠苗數/發芽數 × 100%；（5）綠苗系數（Gc）=綠苗率/萌發率；（6）單位可育種子數（Sf）=蒴果平均種子數（Cs） × 綠苗率。

各指標等級劃分方法參照文獻[13]。1）作為雜交合適度指標，坐果率劃分等級：不能坐果為0、0＜低＜20、20≤中＜40、高≥40；2）作為種子生活力指標，綠苗率劃分等級：無綠苗為0、0＜低＜10、10≤中＜50、高≥50；3）綠苗系數為閾值0 ～1 的相對化指標，劃分等級：無綠苗為0、0＜低＜0.6、0.6≤中＜0.9、高≥0.9；4）作為具有正常生活力種子絕對指標，單位可育種子數劃分等級：無能育種子為0、0＜低＜20、20≤中＜200、高≥200。

將上述指標根據實際數據賦予權重并劃分等級分值，累計得出綜合評分，對雜交可育性進行評價。設總權重（最高分值）為10 分，綠苗率最高5 分，綠苗系數最高2 分，坐果率與單位可育種子數分別最高1.5 分，方案見表1。根據綜合評分將可育性劃分為4 個等級，即0≤無＜2.5 為不育型；2.5≤低＜5 為弱育型；5≤中＜8 為能育型；高≥8 為高育型。

表1 雜交可育性指標等級與權重分配Table 1 Fertility index grades and weight allocations

2 結果與分析

2.1 不同授粉方式下花粉管的熒光觀察

‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合花粉管生長狀況見圖1。雜交授粉8 h 后，切割柱頭法未見花粉萌發，常規授粉法、NAA 涂抹柱頭法、重復授粉法、加熱花粉法、延遲授粉法授粉在雌蕊柱頭上均觀察到花粉的大量萌發。常規授粉2 d 后發現花粉管扭曲，4 d 后花粉管生長近花柱中部，同時發現胼胝質反應，12 d 后僅有少量花粉管到達子房；NAA 涂抹柱頭法授粉4 d 后產生胼胝質反應，6 d 后發現花粉管扭曲纏繞，12 d 后大量花粉管生長到達子房；加熱花粉法花粉管生長迅速，1 d 后到達花柱1/4 處，4 d 后花粉管出現扭曲，8 d 后接近子房，10 d 后生長進入子房；延遲授粉法2 d 后出現花粉管折疊扭曲，6 d 后發現激烈胼胝質反應，12 d 后生長到達子房；重復授粉法2 d后出現花粉管扭曲，6 d 后少量花粉管生長到達子房。

圖1 不同授粉方式雜交后的花粉管熒光觀察Fig. 1 Fluorescence observation of pollen tube after hybridization with different pollination methods

2.2 授粉方式對子房膨大率和坐果率的影響

雜交組合‘西瑪’ × 爆杖花以不同授粉方式雜交后的子房膨大率及坐果率結果見表2。由表2可知，在常規授粉雜交方式中，‘西瑪’ × 爆杖花雜交子房膨大率及坐果率均為0.00%，但是NAA 涂抹柱頭法、重復授粉法、加熱花粉法、延遲授粉法4 種方式均能有效提高雜交子房膨大率及坐果率，說明這些方法能夠有效提高‘西瑪’ ×爆杖花的雜交成功率。其中，重復授粉的子房膨大率最高，達到了58.00%，但坐果率只有50.00%，而切割柱頭法未見子房膨大，說明此法不適用于本雜交組合。

表2 不同授粉方式對雜交親和性的影響Table 2 Effects of different pollination methods on cross affinity

2.3 雜交親和性指標及綜合評價

雜交組合‘西瑪’ × 爆杖花的雜交親和性指標包含蒴果平均種子數、萌發率、綠苗率、綠苗系數和單位可育種子數。經測算得出雜交蒴果平均種子數為252.33，雜交種子的萌發率為15.00%，根據育性指標等級與權重分配結果（表1）可知：雜交種子的綠苗率5.00%為低等，得分1.0；綠苗系數0.33 為低等，得分0.5；單位可育種子數12.62 為低等，得分0.5；根據表2 可得常規授粉下坐果率為0.00%，得分0 分。由以上各單項雜交親和指標進行加合，得出最終雜交可育性綜合評分為2.0，綜合評價‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合可育性為不育型。

3 結論與討論

杜鵑的柱頭可授期一般會持續一段時間，在性成熟時會分泌粘液。有學者的研究表明杜鵑的柱頭開始分泌粘液時可授性開始變強[14-15]，經過測試比利時杜鵑‘西瑪’也有相同的結果，即粘液分泌時柱頭有較強的可授性，因此試驗在確定授粉時機時以開始分泌粘液為認定標準。杜鵑雜交同時存在受精前障礙和受精后障礙[16]。受精前障礙是花粉不能在柱頭上萌發直到子代敗育的階段[13]，障礙表現在花粉管異常膨大、變形甚至是停止生長以至于不能生長到達胚珠[17]，具體表現在授粉后子房不會膨大或無坐果，本試驗中花粉管熒光觀察發現‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合出現了包括花粉管扭曲折疊，產生胼胝質反應或是不能生長到達子房等花粉管異常的情況，推測存在受精前障礙。通過不同的授粉方法可以破除雜交障礙提高雜交的成功率，而不同的授粉方式對不同的雜交組合效果不一致，有可能表現為促進坐果率的提升，也有可能表現出坐果率降低的情況，耿興敏等[18]研究發現以正己烷處理不同的雜交組合，只提高了映山紅 × 猴頭杜鵑（Rhododendron simsii×R. simiarum）和映山紅 × 馬纓杜鵑（R. simsii×R. delavayi）的膨大率，其余雜交組織均表現為膨大率降低。本研究中采用的NAA 涂抹柱頭法、重復授粉法、花粉加熱法、延遲授粉法授粉結果對‘西瑪’ × 爆杖花的子房膨大率和坐果率均顯示為促進作用。此外，切割柱頭法授粉后母本植株上未見坐果，顯示雜交失敗，通過授粉后花粉管熒光觀察的結果發現花粉在柱頭切割處并未見萌發，推測可能是切割柱頭后涂抹的花粉培養液配方不適用，或是由于切口過小，導致培養液揮發失效。因此，切割柱頭法并不適用于所有植物[19]，而切割柱頭法也與花柱的粗細，長短以及切割位置等有關[20-21]。受精后障礙表現在胚珠停止發育，種子不能發芽和后代苗白化等情況[22-24]。本試驗中存在坐果率低于子房膨大率的情況，說明存在胚珠敗育的情況，同時還存在雜交種子萌發率偏低，有白化苗的情況，表明比利時杜鵑‘西瑪’與爆杖花雜交還存在受精后障礙。針對受精后障礙，可通過對雜交幼胚進行拯救等方法來破除，耿興敏等[25]對杜鵑雜交幼胚進行胚拯救，發現不同的雜交組合適宜拯救的胚齡也不同，后期研究可繼續探索杜鵑雜交的受精后障礙破除辦法，為提高杜鵑雜交成功率并獲得更多雜交后代提供參考信息。

雜交親和性的直接指標是受精過程的完成與否，即胚的形成與否，但是胚的檢測存在一定難度，因此有必要取用間接指標來評判雜交的親和性。單果種子數與受精率有關[26]，受精率越高 則種子數越高，雜交種子中具有潛在生活力的種子會萌發成綠苗，不具有生活力的種子則不會萌發或者小苗呈現黃化、白化或畸形以至于最終無法成活[27]，所以綠苗率也是評判雜交親和性的一項重要指標。本試驗選取了子房膨大率、坐果率、蒴果平均種子數及種子萌發率、綠苗率幾項直接指標以及經公式推算得出的綠苗系數及單位可育種子數作為判斷親和性的指標，并劃分等級對其中幾項與雜交親和性相關度較大的指標進行分數評定，最終得出雜交可育性綜合評分，這種評價方法比單純根據子房膨大率、坐果率等指標判斷親和性更加科學。本研究根據雜交可育性綜合評分判定比利時杜鵑‘西瑪’ × 爆杖花雜交組合可育性為不育型。