葡萄籽原花青素提取物預灌胃對造影劑誘導糖尿病大鼠急性腎損傷的預防作用觀察

翟志紅，張海俊，黃輝，牛強

1 石河子大學醫學院第一附屬醫院心內科，新疆石河子 832000；2 石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科；3 石河子大學醫學院預防醫學系

糖尿病是造影劑誘導急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury， CI-AKI）的獨立危險因素［1］。氧化應激在造影劑誘導急性腎損傷的發生發展中起關鍵作用。研究［2］發現，核因子E2相關因子2（Nrf2）-Kelch樣ECH關聯蛋白1（Keap1）信號轉導通路是細胞防御氧化應激的主要系統，被認為是阻斷氧化應激致組織損傷的有效靶點，葡萄籽原花青素 提 取 物（grape seed proanthocyanidins extract，GSPE）是葡萄籽的主要有效活性成分，可清除自由基、抑制氧化應激損傷、修復DNA和線粒體功能受損［3-4］。本課題組前期體外細胞研究［5］發現，GSPE可通過激活Nrf2-Keap1通路蛋白表達，減輕造影劑通過氧化應激損傷導致的人腎小管上皮細胞HK-2凋亡。2021年1—7月，我們觀察GSPE預灌胃對造影劑誘導糖尿病大鼠急性腎損傷的預防作用，進一步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 鼠齡為4周的清潔級雄性SD大鼠60只，體質量90～100 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素（STZ）（ 美國Sigma公司），碘海醇（上海通用電氣藥業，碘含量350 mg/ml），葡萄籽原花青素提取物（天津尖峰天然產物研究開發有限公司，純度＞95.0%，批號：G050412），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物技術研究所），兔多抗 Nrf2、醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素單加氧酶-1（HO-1） 抗體、兔單抗Keap1抗體（武漢博士德生物工程有限公司），TUNEL染色試劑盒（美國R&D公司），光學顯微鏡及攝像系統、病理圖像分析儀（日本奧林巴斯）。

1.2 動物分組及GSPE給予方法 60只SD大鼠適應性喂養1周，高脂高糖飼料喂養4周。取50只大鼠40 mg/kg劑量腹腔注射1%的STZ，造模72 h后連續3天測定大鼠尾靜脈空腹血糖，以連續3次空腹血糖＞11.1 mmol/L為標準，一次性成功41只糖尿病大鼠模型。隨機分為糖尿病組（DM組）8只，糖尿病 +造影劑組（CM組）9只、糖尿病 + 造影劑 + GSPE低劑量組（低劑量組）8只、糖尿病 + 造影劑 + GSPE中劑量組（中劑量組）8只、糖尿病 + 造影劑 + GSPE高劑量組（高劑量組）8只。取另10只肥胖大鼠為空白對照組（NC組），1 mL/kg腹腔注射檸檬酸緩沖液（0.1 mmol/L， pH 4.4）。NC組、DM、CM組大鼠每日用10 mL/kg生理鹽水灌胃1次，第3天灌胃24 h時，NC組、DM組尾靜脈注射5 mL/kg生理鹽水，CM組尾靜脈注射碘海醇（1.8 g I/kg）。低、中、高劑量組大鼠每日分別用50、250、500 mg/kg的GSPE灌胃1次，連續3天，第3天灌胃24 h時尾靜脈注射碘海醇（1.8 g I/kg）。

1.3 各組大鼠腎功能指標檢測 尾靜脈注射藥物48 h各組大鼠斷尾采血，3 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃保存。采用全自動生化儀檢測各組大鼠血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）。重復檢測3次，取平均值。

1.4 各組大鼠腎臟組織氧化損傷指標檢測 采血后處死各組大鼠，分離腎組織，用冰生理鹽水洗滌干凈，將腎組織置于10%中性甲醛溶液固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色后觀察腎組織病理改變。另取腎組織勻漿后采用試劑盒測定腎組織SOD、MDA。重復檢測3次，取平均值。

1.5 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡檢測 取腎組織，采用原位缺口末端標記法 （TUNEL）測算各組大鼠腎小管上皮細胞的凋亡指數，檢測操作嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行，細胞核中有棕黃色顆粒的細胞為凋亡細胞。重復測算3次，取平均值。

1.6 各組大鼠腎組織Nrf2-Keap1通路下游關鍵基因關醌氧化還原酶 1（NQO1）、血紅素單加氧酶-1（HO-1）、Nrf2及Keap1蛋白檢測 取各組大鼠腎組織，采用WESTERN Blotting法檢測各組大鼠腎組織NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，重復檢測3次，取平均值。

1.7 統計學方法 采用 SPSS21.0 統計軟件進行數據分析。采用Shapiro-Wilk檢驗進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以-表示，兩組間比較應用t檢驗，多組比較采用單因素ANOVA方差分析，多組間應用Tukey多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清SCr、BUN水平比較 各組大鼠血清SCr、BUN水平比較見表1。

表1 各組大鼠血清SCr、BUN水平比較（-）

表1 各組大鼠血清SCr、BUN水平比較（-）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與CM組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。

BUN（mmol/L）8.38 ± 1.78*#6.01 ± 1.75#△5.54 ± 0.85#△5.61 ± 0.50#△5.95 ± 1.67#△10.32 ± 2.25*△組別低劑量組中劑量組高劑量組NC組DM組CM組n 8 8 8 1 0 8 9 SCr（μmol/L）65.55 ± 2.45*#57.23 ± 6.01#△55.30 ± 2.94#△55.02 ± 2.33#△56.45 ± 3.65#△78.33 ± 6.37*△

2.2 各組大鼠腎組織勻漿SOD、MDA水平比較 各組大鼠腎組織勻漿SOD、MDA水平比較見表2。

表2 各組大鼠腎組織勻漿SOD、MDA水平比較（-x ± s）

2.3 各組大鼠腎組織病理變化 光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化：NC組腎小球結構及形態正常，腎間質可見少許炎性細胞浸潤。DM組可見部分腎小管上皮細胞腫脹，極少數腎小管上皮細胞可見空泡樣變性，部分間質可見炎性細胞浸潤。CM組腎小球腫脹明顯，腎小囊腔變窄，腎小管上皮細胞發生重度腫脹及空泡樣變性，腎間質炎性細胞浸潤較DM組進一步加重，與其余5組比較，該組腎臟病理改變最為顯著。與CM組比較，中高劑量組腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性及間質炎性浸潤明顯改善。

2.4 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡指數比較 低、中、高劑量組大鼠腎小管上皮細胞凋亡檢數分別為53.92 ± 3.44、25.15 ± 3.33、18.15 ± 3.26，NC 組、DM 組、CM 組分別為 4.79 ± 0.84、25.37 ± 2.84、56.30 ± 4.2。與CM組比較，中、高劑量組大鼠腎小管上皮細胞凋亡指數小（P均＜0.05）。

2.5 各組大鼠腎組織NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白相對表達量比較 各組大鼠腎組織NQO1、HO-1、 Nrf2及Keap1蛋白相對表達量比較見表3。

表3 各組大鼠腎組織NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白相對表達量比較（）

表3 各組大鼠腎組織NQO1、HO-1、Nrf2及Keap1蛋白相對表達量比較（）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與CM組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。

組別低劑量組中劑量組高劑量組NC組DM組CM組Keap1 1.00 ± 0.05 1.03 ± 0.05 1.19 ± 0.01 0.97 ± 0.07 0.94 ± 0.08 0.92 ± 0.01 n8 8 8 1 0 8 9 NQO1 1.86 ± 0.07*＃Δ 2.12 ± 0.10*＃2.69 ± 0.09*＃1.63 ± 0.12 1.51 ± 0.02＃Δ 1.15 ± 0.02*HO-1 1.74 ± 0.04＃Δ 2.23 ± 0.17*＃2.34 ± 0.13*＃1.60 ± 0.10 1.45 ± 0.07＃Δ 1.28 ± 0.11*Nrf2 1.33 ± 0.06＃Δ 1.99 ± 0.11*＃2.02 ± 0.11*＃1.38 ± 0.14 1.12 ± 0.03*＃Δ 0.61 ± 0.07*

3 討論

隨著現代介入技術及影像學的快速發展，含碘造影劑在疾病診斷和治療過程中的使用越來越普遍，造影劑誘導急性腎損傷日益受到重視。造影劑誘導急性腎損傷不僅影響患者的預后，亦可顯著增加患者遠期心血管及腎臟不良事件［5］。因此，重視造影劑誘導急性腎損傷的早期防治，具有重要的臨床和現實意義。

目前有關造影劑誘導急性腎損傷的發病機制仍未充分闡明，多數研究認為含碘造影劑致腎小管供氧失衡和對細胞直接毒性是其發生和發展的主要機制［6-7］，其中氧化應激損傷是其發生發展的關鍵環節［8］。在氧化應激情況下，活性氧（ROS）過量生成是多數腎臟病變的共性，ROS能夠激活對氧化還原敏感的轉錄因子及信號傳導通路，引起細胞凋亡、組織損傷、壞死、炎癥及纖維化等病化。研究表明，在基礎腎功能正常的人群中，糖尿病被認為是造影劑誘導急性腎損傷的獨立預測因子［1］。本研究發現，糖尿病大鼠給予造影劑尾靜脈注射后，其腎功能指標顯著下降，氧化應激損傷指標SOD水平顯著降低，MDA水平明顯升高，其原因可能為在高血糖狀態下，腎臟組織已處于明顯的氧化應激狀態，大量的氧自由基對腎臟循環產生縮血管效應，在一定程度上加重腎臟的缺血，在使用造影劑后加劇氧化應激損傷，從而更易發生嚴重的急性腎損傷。HE染色也顯示，糖尿病大鼠給予造影劑干預后，其腎小球病理改變顯著，主要表現為腎小球腫脹明顯，體積變大，腎小球囊腔變窄，腎小管上皮細胞出現重度腫脹及空泡樣變性，腎間質被大量炎性細胞浸潤。含碘造影劑既可以通過直接毒性損傷血管內皮細胞，誘發糖尿病大鼠腎小管上皮細胞空泡化變性及部分細胞壞死，又能夠激活氧化應激系統，產生大量的ROS集聚體內，導致腎臟組織損傷。因此，阻斷或者減輕氧化應激反應對降低DM患者發生造影劑誘導急性腎損傷具有重要臨床意義。

Nrf2在腎臟疾病的發生發展中具有重要作用。激活Nrf2可以提高細胞或組織的抗氧化應激能力，從而減輕機體損傷。Khaleel 等［9］研究發現，在造影劑誘導急性腎損傷大鼠模型中，SCr和BUN水平明顯升高，Nrf2基因的表達受到抑制，其調控的下游基因HO-1、NQO1過表達。給予糖尿病小鼠及高糖干預的腎小球系膜細胞Nrf2激動劑叔丁基對苯二酚（tBHQ）后，腎臟和腎小球系膜細胞氧化應激損傷明顯減輕，其作用機制與Nrf2 信號通路的激活有關［10］。由此可以看出，Nrf2活化劑介導的Nrf2 活化以及調控下游抗氧化酶的表達可能在預防造影劑誘導急性腎損傷過程中發揮重要作用，但目前還沒有某一抗氧化劑能有效防治造影劑誘導急性腎損傷。

葡萄籽原花青素提取物是從葡萄籽中提煉出來的天然多酚化合物， 研究顯示，葡萄籽原花青素提取物可以降低炎癥水平，提高抗氧化酶水平，抑制氧化應激損傷和線粒體功能受損，緩解2型DM大鼠的腎功能損傷［11］，亦可以改善糖尿病大鼠腎缺血再灌注損傷［12］。本研究結果顯示，糖尿病大鼠給予不同劑量的葡萄籽原花青素提取物灌胃預處理后，腎功能指標SCr、BUN水平呈劑量依賴性下降，氧化應激損傷指標SOD水平呈劑量依賴性升高，MDA水平呈明顯下降趨勢。腎臟組織HE染色顯示CM組腎組織病理損害最為顯著，給予由低到高不同劑量的葡萄籽原花青素提取物灌胃預處理后，各組腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性及間質炎性浸潤逐漸改善。結果提示，葡萄籽原花青素提取物能夠減輕含碘造影劑對糖尿病大鼠的腎臟損傷，并與劑量相關。有研究表明，葡萄籽原花青素提取物能夠升高順銹鉑誘導腎病小鼠體內的SOD 含量，通過抗氧化作用對順銹鉑誘導的腎病小鼠起到保護作用［13］。王芳等［14］研究發現，原花青素能夠升高糖尿病小鼠血清SOD含量，而降低MDA的水平，從而改善機體的氧化應激損傷。針對葡萄籽原花青素提取物是否能預防造影劑誘導急性腎損傷引起的腎小管上皮細胞凋亡，本研究采用TUNEL法檢測了各組細胞凋亡情況，發現葡萄籽原花青素提取物具有劑量依賴的抗細胞凋亡作用。

氧化應激損傷是公認的導致細胞凋亡的重要機制之一，Nrf2-Keap1信號通路是抗氧化應激的主要細胞防御系統，是阻斷氧化應激致組織損傷的有效靶點［15］。在正常情況下，Nrf2通過與負性調控因子Keap1的結合，以非活性胞質形式存在，從而促使Nrf2的降解［16］。抗氧化觸發Nrf2與Keap1發生解離并Nrf2核易位，然后結合到抗氧化反應元件（ARE），激活內源性抗氧化系統，促進各種抗氧化酶的活化，從而發揮其抗氧化應激的作用［17］。有研究［18］證明，增加小鼠 Nrf2 及其下游靶基因HO-1、NQO1的表達可以改善腎小管上皮細胞凋亡，且肌酐、尿素氮含量明顯降低。給予抗氧化劑激活 Nrf2 信號通路可以緩解缺血再灌注導致的腎損傷［19-20］。以上研究均表明，Nrf2 可以通過上調下游抗氧化酶的表達，從而緩解氧化應激損傷，使腎臟得到相應的保護。本研究結果顯示，糖尿病大鼠給予造影劑干預后，其Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達顯著降低，證明了在糖尿病狀態下造影劑可以明顯抑制Nrf2信號通路，抑制抗氧化酶HO-1、NQO1的表達，加重氧化應激損傷。給予不同劑量的葡萄籽原花青素提取物預處理后，發現葡萄籽原花青素提取物可以上調糖尿病大鼠腎臟 Nrf2 的蛋白及mRNA的表達，并且可以上調Nrf2信號通路下游相關基因HO-1、NQO1 的蛋白及mRNA的表達，緩解腎臟損害。表明葡萄籽原花青素提取物可激活Nrf2的表達并參與介導轉錄，從而降低腎組織的氧化應激損傷。

綜上所述，葡萄籽原花青素提取物預灌胃的尾靜脈注射造影劑糖尿病大鼠血清SCr、BUN水平低，腎組織勻漿組SOD水平高、MDA水平低，腎小管上皮細胞凋亡指數小，且500 mg/kg時效果最好。葡萄籽原花青素提取物可能通過促進腎組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達，進一步抑制腎組織MDA表達，發揮抗氧化應激損傷作用。