PCR 技術及其在食品微生物檢測中的運用策略

◎薛 磊

（山西開放大學，山西 太原 030000）

當前，我國的飲食結構發生了顯著變化，為了滿足消費需求，市場中的食品類型越來越多樣化。為了保障食品安全，必須強化食品質量安全檢測工作，而食品微生物含量檢測是食品檢測工作中的重要組成部分，因為諸多食物腐爛變質的原因就在于微生物含量超標，一旦食用，極易損害人體健康，甚至威脅生命，所以必須針對食品微生物進行有效檢測。在此過程中建議應用PCR 技術，因為其具有高效性和準確性的特點，可以有效提升食品微生物檢測工作的質量和效率[1]。

1 PCR 技術

1.1 概念和原理

PCR 技術誕生于1985 年，一經問世即成為基因工程中的主要技術手段之一，食品微生物檢測工作也因此更加便捷和有效。當前，我國對于PCR 技術的應用已經發展至針對各類日常食品的微生物含量進行檢測。PCR 技術的基本原理如下：在PCR 體系下加熱食物，如果食物中含有微生物，則相應的核酸序列能夠受到溫度變化影響，出現變形情況。通常情況下，PCR 體系投入應用的初始階段，可以將其溫度調節至94 ℃，微生物DNA 能在此溫度環境下裂解成為單鏈，但是需要注意對PCR 體系中的溫度進行合理控制，若溫度過高，則會直接殺死微生物。在微生物DNA 裂解成為單鏈以后，再進行降溫處理，將PCR 體系溫度調節至55 ℃，之后再調節至72 ℃，使引物與模板DNA 結合，DNA 聚合酶則可合成新DNA 鏈，之后反復進行上述步驟，確認檢測對象中有無特異性DNA 片段，即可確定食品中有無微生物以及微生物含量。同時，特異性引物只能在微生物上生長，且檢測便捷性大于微生物，所以應用PCR 技術的便捷性和準確性均更高[2]。

1.2 原料

在應用PCR 技術的過程中，需要應用的原料主要包括引物、dNTPs、DNA 聚合酶、緩沖液、Mg++、核酸模板。

2 以PCR 技術為基礎的檢測方法

PCR 技術當前已經在食品微生物檢測工作中得到了廣泛應用，可針對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種微生物進行準確檢測，還可對食品樣品中的物質進行微量檢測工作，可精確至1 pg[3]。可見PCR 技術在食品微生物檢測中，能夠呈現較高的應用價值。以此為基礎，將PCR 技術實際應用于食品微生物檢測工作中，可以根據其主要形式劃分為不同的檢測方法。

2.1 常規PCR 檢測法

將目標物質相應的DNA 模板以及引物混合，再加入適量聚合酶。在適宜的溫度環境和催化條件下，聚合酶可以加速目標物質DNA 模板序列的擴增，經過數次DNA 復制，即可獲取DNA 片段，且這一DNA 片段即循環DNA 模板，可繼續復制和擴增。將目標物質放大以后，針對其中的特定DNA 開展標記測定工作，即能夠獲取物質中的微生物含量。

2.2 多重PCR 檢測方法

將多個模板與多條引物混合于同一反應體系中，并分別進行特異擴增，形成不同的目的條帶，或是單一模板DNA 與多條引物在一個反應系統中，針對同一模板中的不同片段進行擴增，也可針對超長片段實施擴增處理[4]。相對于常規形式的PCR 檢測方法，其能夠呈現產物特異性高、擴增效率高以及經濟簡便等優勢，適用于食品檢測工作中多種致病菌的檢測。

2.3 PR-PCR 檢測方法

該檢測方法屬于常規PCR 檢測方法的變形，首先針對檢測目標中的一條RNA，將其逆轉錄并獲取能夠與其互補的DNA，然后將DNA 鏈作為模板，使用常規PCR 技術擴增復制DNA。在這一過程中，難點為RNA的逆轉錄，必須保障RNA 模板處于完整狀態，并且其中不可含有雜質（如DNA、蛋白質等）[5]。

3 PCR 技術在食品微生物檢測中的應用

PCR 技術具有靈敏度高、特異性強、準確率高的特點，因此得到了迅速發展。同時，應用范圍不斷得到拓展，不僅能夠在基因篩選、基因克隆、制備特異探針和基因表達調控等方面進行應用，而且當前已在農業科學、醫學、食品科學、考古學以及環境科學等多個領域受到了充分重視。例如，將PCR技術應用于食品微生物檢測工作中，能夠起到較好的應用效果。

3.1 食品樣品致病菌檢測

開展食品樣品致病菌檢測工作時，若應用傳統方法，不僅過程煩瑣，而且局限性顯著，需要首先富集培養被檢測微生物，直至其數量增長至可檢測水平，方可分離微生物，并針對其形態特征進行觀察，最后開展生理化鑒定。同時，對于人工培養難度較大的微生物來說，應用傳統樣品難以有效開展檢測工作。在細菌中，編碼rRNA 的基因具有較強的保守性，當應用PCR 技術時，其中的DNA 片段可以適當擴張，也就可以對樣品中的細菌及致病菌進行快速且準確的檢測，即使針對人工無法培養的各種微生物，也可起到良好的檢測效果。在應用PCR 技術檢測食品樣品致病菌時，需要針對靶DNA 進行抽提，采用過濾或者離心的方式獲取樣品中的細菌細胞，再裂解細胞，實施核酸純化，使其適用于PCR 技術，即可開展檢測工作。

3.2 乳酸菌檢測

可以產生乳酸的細菌均可被稱為乳酸菌，當前多數乳酸菌屬于有益菌，可起到促進胃腸消化、優化腸道功能和降低血清膽固醇含量等多方面作用，有利于提升機體免疫力和維持人體健康，但是有少數乳酸菌會對人體產生危害，所以購買食物時，消費者會仔細查看食品乳酸菌含量，所以需要準確檢測食品中的乳酸菌含量。

我國針對乳酸菌檢測工作的研究開展時間較早，當前已經可以明確，乳酸菌DNA 序列1 414～1 432位置上的21 個堿基排列具有顯著代表性，并且多種類型的乳酸菌具有這一堿基排列，目前可以確認包含雙歧桿菌在內的32 類乳酸菌均是如此。所以，針對乳酸菌含量開展檢測工作的主要內容，即為針對上述的21 個堿基排列進行檢測，獲取這一序列時，應該使用SDS 方法裂解乳酸菌細胞，再借助蛋白酶去掉細胞中的蛋白質，即能獲取乳酸菌核酸，且可保障其完整性，之后提取所需的基因片段并對相應的引物進行研究。因為這一片段為乳酸菌特有的類型，所以引物不會與其他物質結合，也就可以對乳酸菌含量進行準確檢測[6]。

3.3 生活飲用水細菌檢測

飲用水水質檢測工作內容主要為檢測大腸桿菌類以及人類糞便污染的大腸桿菌。傳統的檢測方式需要共同培養細菌與將要進行檢測的可以利用乳糖的革蘭氏陰性菌，整體過程較為煩瑣，耗費時間長。若能利用-半乳糖苷酶，則可使用明確的底物開展檢測工作，更有利于提升檢測效率。但是，部分大腸桿菌不能對-葡萄糖醛酸苷酶進行表達，所以檢測必然存在一定的失敗概率，導致檢測工作的效率受到影響。應用PCR技術開展-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因檢測工作，其中的靈敏性和特異性可得到顯著提升。由于PCR 技術可以起到擴增-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因的作用，能夠從水樣中分別檢測到大腸桿菌類以及大腸桿菌。通常情況下，選擇應用經過擴增的-半乳糖苷酶為活體開展培養工作，可以同時檢測到同一類型的大腸桿菌類，而使用經過擴增的-葡萄糖醛酸苷酶進行檢測，則可檢測出一種大腸桿菌以及志賀氏菌。另外，應用PCR 技術，僅需數小時即可完成檢測工作，準確性和效率較高[7]。

3.4 啤酒腐敗菌檢測

當前，我國啤酒產量大且種類多，市場廣闊，啤酒生產過程中需要發酵，且乳酸桿菌在其中占據重要地位。與此同時，啤酒花中含有異A 酸，其能起到抑菌作用，能夠對乳酸菌產生一定的影響。根據相關研究顯示，乳酸桿菌之所以能起到抑制異A 酸生長的作用，原因在于其中含有horA 基因，這一基因易引起啤酒變質，即horA 基因能夠對啤酒花產生抗性。啤酒敗菌檢測方法是以horA 基因順序為基礎合成相應的特異性產物，再加入DNA 聚合酶以及乳酸桿菌DNA提取液，通過電泳檢測混合產物的檢測方法。應用這一方法檢測啤酒中的腐敗菌，僅需耗時6 h，相對于傳統模式下的檢測,效率顯著提升。

4 結語

一直以來，食品安全問題是我國社會發展過程中的重點問題，所以必須重視食品檢驗檢測工作PCR 技術具有高準確度、高靈敏度的優勢，在食品微生物檢測中的應用效果良好，未來仍需積極推動該技術發展，以促使我國食品安全監管工作水平的不斷提升。