免疫檢查點阻斷轉化醫學研究進展

何軍芳

（上海旭東海普藥業有限公司 上海 201206）

阻斷T細胞免疫檢查點通路是腫瘤治療策略之一，但現僅小部分患者能自此類免疫治療中獲益，相關藥物主要包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、程序性細胞死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）和程序性細胞死亡受體配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制劑等。抑制性免疫檢查點CTLA-4和PD-1除了調控急慢性炎性反應、抗腫瘤等免疫反應之外，還與機體免疫耐受相關，在保護機體免受自身免疫反應方面起著重要作用。因此，使用免疫檢查點抑制劑治療會導致發生不同程度的免疫相關不良事件。為使更多腫瘤患者從免疫治療中獲益，改善患者預后，國內外開展了大量的免疫檢查點阻斷相關的轉化醫學研究。本文以抗腫瘤免疫反應相關的代表性免疫細胞為例，包括樹突狀細胞、耗竭CD8+T細胞（exhausted CD8+T cells，Tex細胞）和調節性T細胞（regulatory T cells，Treg細胞），概要介紹免疫檢查點阻斷相關的轉化醫學的研究進展。

1 腫瘤調控樹突狀細胞抗原提呈以逃避免疫識別

CD8+T細胞是特異性抗腫瘤免疫反應的主要功能性細胞，而樹突狀細胞在抗腫瘤T細胞免疫的啟動和維持中起著核心作用，是體內抗原提呈能力最強的一類細胞。在抗腫瘤免疫反應過程中，樹突狀細胞首先攝取腫瘤抗原并通過人白細胞抗原Ⅰ（classⅠhuman leukocyte antigens，HLA-Ⅰ）交叉提呈以啟動初始CD8+T細胞，啟動后的CD8+T細胞對由HLA-Ⅰ直接提呈的腫瘤抗原進行免疫識別，進而殺傷腫瘤細胞[1]。

腫瘤內的自然殺傷細胞通過分泌趨化因子CCL5和XCL1招募樹突狀細胞中的傳統1型亞群（conventional type 1 dendritic cells，cDC1）進入腫瘤微環境[2]。cDC1攝取已死亡腫瘤細胞釋放的特異性抗原后不斷成熟，遷移至腫瘤引流淋巴結（tumor-draining lymph node，TDLN）后對腫瘤抗原進行加工處理，然后加載至HLA-Ⅰ，交叉提呈于CD8+T細胞，同時上調共刺激分子CD80等表達并產生促炎細胞因子，充分啟動初始T細胞[3]。

自然殺傷細胞-cDC1軸與腫瘤患者的遠期生存相關，而腫瘤源性前列腺素E2能減弱自然殺傷細胞的功能，使其趨化因子產生減少，并下調cDC1趨化因子相關受體的表達，導致cDC1招募減少[2]。在對免疫檢查點抑制劑耐藥的腫瘤內有一類富含免疫調節分子的成熟樹突狀細胞，研究發現存在腫瘤抗原攝取相關的調節程序：由受體酪氨酸激酶AXL誘導PD-L1表達上調，白介素-12表達上調則嚴格依賴于干擾素-γ水平并受白介素-4信號傳導的負向調控，由此減弱cDC1的免疫功能，從而限制TDLN中的T細胞活化[4]。此外，腫瘤內樹突狀細胞的氧化脂質水平升高，并可通過與熱休克蛋白70共價結合，介導抑制樹突狀細胞對腫瘤抗原的交叉提呈[5]。

總之，腫瘤細胞能利用多種免疫逃逸機制在腫瘤抗原提呈過程中逃避免疫識別及殺傷，它們除可直接調控自身抗原加工和下調HLA-Ⅰ表達之外，還可通過影響cDC1招募、成熟和抗原交叉提呈等環節，抑制cDC1的抗腫瘤免疫功能。因此，腫瘤區域的樹突狀細胞經常呈現功能失常、耐受性甚至免疫抑制性表型。對經免疫檢查點抑制劑治療反應不良的免疫抑制性腫瘤，聯用干擾素基因刺激因子激動劑可以克服免疫抑制信號并誘導樹突狀細胞成熟，提高免疫治療效果[6]。

2 阻斷樹突狀細胞PD-L1可增強T細胞CD28信號傳導

研究發現，通過PD-L1激活PD-1信號通路，募集蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2，可使T細胞共刺激受體CD28去磷酸化，從而阻斷CD28信號傳導，抑制T細胞活化，表明PD-L1/PD-1信號通路主要通過減弱CD28的共刺激信號而調節效應T細胞的功能[7]。

樹突狀細胞表達的PD-L1既可與T細胞的PD-1結合，由此傳遞抑制性信號，也可與自身的B7-1（CD80）發生相互作用，進而阻斷B7-1/CD28共刺激信號，抑制T細胞活化和細胞因子產生[8]。PD-L1/B7-1的親和力介于B7-1/CD28和B7-1/CTLA-4之間[8]。

進一步的研究發現，腫瘤相關樹突狀細胞的PD-L1表達水平高于B7-1，且其PD-L1可與B7-1順式結合，而其他游離的PD-L1則與T細胞的PD-1反式結合[9]。給予抗PD-L1抗體除了可阻斷PD-L1/PD-1抑制性信號傳導之外，還可破壞PD-L1/B7-1的順式結合，釋放被PD-L1結合的B7-1，使得B7-1能與CD28結合而提供共刺激信號，增強T細胞啟動[9]。實驗表明，給予抗PD-1抗體后，CD28的信號傳導增強了32%；再加用抗PD-L1抗體，CD28的信號傳導增幅提高至52%[9]。臨床上觀察到，在接受阿替利珠單抗治療的腎細胞癌和非小細胞肺癌患者中，腫瘤相關PD-L1+樹突狀細胞的存在與患者臨床獲益增加相關，這與上述基礎研究結果一致[9]。

此外，有研究證實，敲除樹突狀細胞的PD-L1可顯著限制腫瘤生長，增強抗腫瘤CD8+T細胞免疫反應[10]。盡管腫瘤微環境中的巨噬細胞、樹突狀細胞和部分腫瘤細胞均可表達PD-L1，但樹突狀細胞表達的PD-L1在抗腫瘤免疫中起著關鍵作用[10]。該研究結果同樣確認了樹突狀細胞在PD-L1/PD-1信號通路中的重要作用，有助于更深入地理解通過免疫檢查點阻斷治療腫瘤的機制。

3 阻斷PD-1信號通路可擴增具有循環潛能的Tex細胞亞群

與急性感染或接種疫苗后初始CD8+T細胞活化成為效應T細胞和記憶T細胞，進而發生有效的免疫應答并形成免疫記憶不同，慢性感染或腫瘤患者體內的T細胞因持續暴露于抗原或炎癥信號，CD8+T細胞常呈現耗竭狀態（Tex細胞），主要表現為逐漸喪失免疫效應功能、持續高表達抑制性受體、代謝失調、無法形成免疫記憶和穩態自我更新差，以及明顯改變了的轉錄和表觀遺傳特征[11]。

鑒于Tex細胞的異質性，有研究者結合相關轉錄因子和細胞活化標志物表達衍變，確定了由Ly108［轉錄因子T細胞因子1（T cell factor 1，TCF1）表達的替代標志物］和CD69（與細胞增殖負相關）定義的Tex細胞的4階段發育軌跡，即Tex祖細胞1（Ly108+CD69+，Texprog1）、Tex祖細胞 2（Ly108+CD69-，Texprog2）、Tex中間體細胞（Ly108-CD69-，Texint）和 Tex終末期細胞（Ly108-CD69+，Texterm）[12]。Texprog1受限于淋巴組織且呈靜止狀態，其不能進入血液循環，但可與Texprog2相互轉化；Texprog2可啟動細胞周期并能進入血液循環，在細胞分裂及轉化為Texint過程中逐漸喪失TCF1表達，同時轉錄因子Tbet表達顯著上調；Texint與可進入血液循環的真正的效應T細胞較為相似，盡管在表觀遺傳方面并不相同；Texint在轉錄因子Tox的調控下最終轉化為Texterm，后者逐漸喪失免疫效應功能[12]。在Ⅳ期轉移性黑色素瘤患者中使用T細胞受體αβ作為分子條碼，顯示血液循環中克隆擴增的抗腫瘤CD8+T細胞表達免疫效應功能的基因特征，而與之匹配的腫瘤浸潤性T細胞表達終末期耗竭的基因特征[13]，基本對應于上述研究中的Texint和Texterm。

研究發現，阻斷PD-1信號通路可優先擴增具循環潛能的Tex細胞亞群，Texprog2和Texint的數量分別增加了17和10倍，且阻斷PD-1信號通路可促進Texprog2轉化為Texint[12]。一項對基底細胞癌或鱗狀細胞癌患者在接受PD-1抑制劑治療前后的克隆T細胞動力學分析顯示，具有耗竭表型的CD8+T細胞的克隆擴增并非源自預先存在的腫瘤浸潤性T細胞，而是出現了新的腫瘤特異性T細胞的克隆替代[14]，這與阻斷PD-1信號通路后擴增的新的Texint可轉化為Texterm的推演相符。

T細胞耗竭伴隨代謝失調，PD-1交聯會減弱磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的信號傳導，抑制有氧糖酵解；與此同時，腫瘤細胞與Tex細胞爭奪葡萄糖以啟動有氧糖酵解，并導致大量乳酸蓄積于腫瘤微環境，使Tex細胞進一步耗竭[11]。阻斷PD-1信號通路可讓具有一定免疫效應功能的Texint的葡萄糖攝取增加，滿足其增殖和恢復活力所需的生物能量需求，從而增強抗腫瘤免疫反應[12，15]。

CD8+T細胞耗竭是目前臨床上開展腫瘤免疫治療所遇到的主要問題，嚴重影響了通過阻斷PD-1信號通路治療腫瘤的臨床效果。通過轉錄/表觀遺傳TCF1-Tbet-Tox軸調控的Tex細胞的發育軌跡，可充分了解Tex細胞亞群的異質性及其相關特征的動態變化情況。然而，新近研究認為，調控Tex祖細胞向效應樣T細胞轉化的核心轉錄因子為BATF而不是Tbet[16-17]?？傊?，通過調控轉錄/表觀遺傳的方式，促進Tex祖細胞轉化為具有一定免疫效應功能的Texint，并使之較長時間地停留于此階段，或者避免嵌合抗原受體T細胞發生耗竭，更好地發揮CD8+T細胞的抗腫瘤作用，是上述幾項研究開展的共同目的。

4 腫瘤微環境有助于穩定Treg細胞的免疫抑制功能

隨著腫瘤免疫治療從最開始用于晚期腫瘤、術后輔助治療，逐步拓展至也用于術前新輔助治療，與此類治療相關的免疫相關不良事件越來越為人熟知，與之密切相關的Treg細胞受到臨床關注。Treg細胞屬于CD4+T細胞中具有免疫抑制功能的細胞亞群，其主轉錄因子為叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3），可識別自身抗原并形成免疫耐受，在維持機體免疫穩態中起著重要的作用[18]。

與CD8+T細胞活化后誘導表達CTLA-4不同，FOXP3+Treg細胞組成型表達CTLA-4，CTLA-4在Treg細胞發育中起著關鍵作用[19]。Treg細胞可借助CTLA-4通過跨內吞作用從樹突狀細胞表面去除CD80和CD86，從而移去T細胞活化所需的共刺激信號[19]。此外，CTLA-4可抑制PI3K-蛋白激酶B信號通路，以避免Treg細胞向致病性1型輔助性T細胞樣細胞轉化而引發自身免疫疾病[19]。腫瘤浸潤性Treg細胞同時高表達PD-1，與CTLA-4等抑制性免疫檢查點一起抑制PI3K-蛋白激酶B信號通路，抑制細胞增殖，維持Treg細胞免疫抑制功能的穩定性[19]。

Treg細胞的免疫抑制功能可能被腫瘤細胞利用，從而逃避機體免疫監視。對116份黑色素瘤樣本的分析證實，在存在極高腫瘤抗原負荷的情況下，黑色素瘤細胞可表達人白細胞抗原Ⅱ，向Treg細胞提呈腫瘤抗原，直接激活和擴增Treg細胞，調控局部免疫抑制微環境，最終發生免疫逃逸[20]。

腫瘤細胞和腫瘤浸潤性CD8+T細胞由于細胞增殖的代謝需求，在腫瘤微環境中均可轉換為高度糖酵解代謝方式（Warburg反應），但在葡萄糖攝取方面，腫瘤細胞遠勝于CD8+T細胞[21]。相比之下，FOXP3+Treg細胞更能從氧化磷酸化中獲取能量，從而維持自身的免疫抑制功能[21]。研究發現，腫瘤內Treg細胞可通過上調甾醇調節元件結合蛋白的活性、協調脂質合成而增強Treg細胞的功能，上調PD-1的表達，增強抑制性受體的信號傳導[22]。

在高度糖酵解導致的低葡萄糖、高乳酸水平的腫瘤微環境中，Treg細胞能通過單羧酸轉運蛋白1主動攝取乳酸，促使活化T細胞核因子1移位進入細胞核，從而上調PD-1表達，同時抑制效應T細胞的PD-1表達[23]。此時，阻斷PD-1可激活表達PD-1的Treg細胞，導致免疫治療失敗，提示可同時將Treg細胞的單羧酸轉運蛋白1作為干預靶點[23]。在呈低糖酵解狀態的腫瘤微環境中，阻斷CTLA-4可導致Treg細胞表型和功能不穩定，產生干擾素-γ和腫瘤壞死因子，增強腫瘤特異性CD8+T細胞免疫反應，提示CTLA-4抑制劑聯用特異性腫瘤有氧糖酵解抑制劑能提高對高度糖酵解腫瘤免疫治療的效果[24]。

5 展望

腫瘤免疫治療借助機體免疫反應清除腫瘤細胞，腫瘤免疫治療藥物的作用機制遠較激酶抑制劑等腫瘤靶向治療藥物復雜。參與腫瘤免疫治療的樹突狀細胞、CD8+T細胞和Treg細胞在維持機體免疫穩態中各有各的作用，人為阻斷免疫檢查點進行干預必然會對機體免疫穩態造成不同程度的影響。腫瘤免疫治療過程中伴隨發生的免疫相關不良事件可能與外周Treg細胞消耗或其免疫抑制功能減弱相關，這在臨床上使用可介導抗體依賴性細胞毒性（antibody-dependent cytotoxicity，ADC）的CTLA-4抑制劑伊匹木單抗治療時表現得尤為明顯[25]。在伊匹木單抗單藥用于黑色素瘤術后輔助治療的Ⅲ期臨床試驗中，高達54%的患者發生了3～5級治療相關不良事件，使之臨床應用受到嚴重限制[26]。而另一個無ADC效應的CTLA-4抑制劑曲美木單抗單藥治療黑色素瘤等的臨床試驗均以失敗告終，提示阻斷CTLA-4的治療機制比較復雜且存在不確定性。阻斷PD-1可導致CD8+T細胞和Treg細胞的早期活化和增殖，臨床上觀察到小部分晚期胃癌患者治療期間出現腫瘤超進展現象，提示阻斷PD-1對CD8+T細胞和Treg細胞的相對影響可能在決定臨床療效方面起著重要作用[27-28]。總之，對于阻斷CTLA-4、PD-1等免疫檢查點進行持續、深入的轉化醫學研究，有助于實現腫瘤免疫治療的精準化和個體化，在提高臨床療效的同時減少免疫相關不良事件的發生，更好地改善患者的預后。