功能性益生菌的篩選及在食品中應用進展

汪洪濤，孫梓秋

（江蘇經貿職業技術學院健康學院，江蘇南京 211168）

近年來，隨著社會的不斷發展，消費者提高了對健康方面的意識，更加重視食品營養相關的問題。而益生菌是指通過攝入足夠的數量，為宿主生物體提供一種或多種特定的并具有臨床證明的功能益處的“活的微生物”的總稱[1]，因其具有抵抗病原菌的入侵維持腸道菌群平衡[2]、可以通過調節宿主特異性和非特異性免疫來增強機體的先天免疫能力[3]、對經典抗性細菌和其他新興抗性微生物具有顯著的抑制作用[4]、可以合成人體必需的B族維生素、多種氨基酸和礦物質以此來改善宿主的健康狀況[5]、抑制癌細胞的增殖速度以及降低腫瘤和一些過敏等慢性疾病的發病率[6]等生理功能，故含有益生菌的食品在市場上變得流行起來并受到廣泛的關注，使功能益生菌的研究成為焦點。本文旨在通過對不同益生菌的篩選途徑及在食品中的開發應用方面進行探究，為益生菌進一步的開發研究提供理論借鑒。

1 益生菌的種類

益生菌的種類繁多，分布廣泛。目前益生菌大致被分為乳桿菌類（乳酸乳桿菌、發酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌等）、雙歧桿菌類（兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌等）、芽孢桿菌類（巨大芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌等）、鏈球菌類（嗜熱鏈球菌、乳鏈球菌、肺炎鏈球菌等）和其他類（酵母菌、大腸桿菌等）五種類型[7]。目前最常用的益生菌主要有酵母菌、乳桿菌、雙歧桿菌等。

2 益生菌的篩選標準及篩選途徑

2.1 益生菌的篩選標準

篩選益生菌需要滿足以下三個核心特征：安全無害并對機體有健康的功效、保持活菌的狀態、有足夠的數量。同時根據《食品益生菌評價指南》，通過體外試驗篩選益生菌時耐酸性和膽汁穩定性以及腸道黏膜黏附特性也是益生菌篩選的標準之一[8]。傳統上，食品中益生菌的質量控制僅依賴于檢測，以確保在產品的整個保質期中存在足夠數量的活菌。益生菌菌株也必須保留其最本質的功能特征，這些特征包括在胃和小腸內生存的能力、耐受酸性條件能力、在膽汁存在下生存和生長的能力等。同時粘連特性是評價腸道屏障作用的重要質量控制方法，包括粘連與縮短腹瀉持續時間、免疫原效應、競爭性排斥等[9]。

2.2 功能性益生菌的篩選途徑

2.2.1 降血脂血糖的益生菌篩選

目前由于人們飲食不合理而導致攝入的能量及飽和脂肪酸和反式脂肪酸過多，從而引發一系列的高血脂、動脈粥樣硬化等心血管疾病。國內外的一些研究表明特定的益生菌可通過改善宿主代謝降低心血管疾病發生風險[10]。GAO Y R等[11]利用體外降膽固醇等功能評價試驗，從中國傳統的發酵黃瓜中篩選出具有降低膽固醇和甘油三酯功能的嗜酸乳桿菌L2-16和糞腸球菌L2-73。這兩種菌株未來可在發酵蔬菜、牛奶、肉類等發酵食品以及具有降血脂、降肝脂功能的益生菌制劑生產中進行應用。WON S M等[12]從韓國11種泡菜中分離得到的清酒乳桿菌ADM14能抑制3T3-L1細胞的脂質積累，該菌具有益生菌潛力和替代治療補充劑的潛力，且具有較高的安全性和生存能力。WANG J B等[13]以國內外特色食源性物質為乳酸菌來源，通過測定菌株α-葡萄糖苷酶抑制能力，篩選出的鼠李糖乳桿菌LB1lac10具有降低血糖的功效，同時確定了該菌所產胞外多糖EPS1-1也有可能作為天然α-糖苷酶抑制劑來調節血糖濃度，該菌及其胞外多糖未來在降血糖食品的開發方面具有一定的潛力。

2.2.2 降血壓的益生菌篩選

現代人的一些不好生活習慣如久坐不動、長期飲酒、吸煙、焦慮等都會是導致高血壓的因素。關于人體研究的薈萃分析結果表明，補充益生菌可以降低血壓[14]。腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）在血壓調節過程中具有重要作用，某些益生菌比如乳酸桿菌和雙歧桿菌可以通過血管緊張素轉移酶（angiotensin converting enzyme，ACE）控制RAS從而具有降壓作用[15]。KORHONREN H[16]研究表明，從乳蛋白中提取的具有生理活性的多肽具有減少輕度高血壓的功效。發酵乳制品如酸奶和奶酪中含有多種天然形成的生物活性肽，肽在母體蛋白質分子的序列中是不活躍的，但可以用蛋白水解發酵劑發酵牛奶或蛋白水解酶水解而釋放出ACE抑制肽，進而產生降低血壓的作用。TSAI J S等[17]用5種乳酸菌（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌）在42 ℃下發酵豆乳30 h，發酵5 h后加入蛋白酶。發酵后從豆漿中分離出乳清。然后用乳清（肽質量濃度10 mg/mL）作為飲料給予自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）8周，口服8周后SHR大鼠收縮壓降至19.0 mmHg。上述有關結果表明，未來利用乳酸菌在開發一些具有降血壓的蛋白制品方面具有一定的潛力，可以進一步的開發利用。

2.2.3 增強機體免疫力的益生菌篩選

益生菌在進入人體后可以黏附在腸道內，通過改善腸黏膜的保護功能，促進特異性和非特異性抗體的形成，提高腸道黏膜的抵抗力和改善免疫系統[18]。BU Y S等[19]研究發現，植物乳桿菌Q7、F3-2和YRL45均具有益生潛能，對胃腸道環境和腸道定植具有耐受性，在腸道屏障中表現出不同程度的抗炎活性和緊密連接功能，減輕炎癥反應，有利于保護腸屏障。結果表明，菌株Q7、F3-2和YRL45具有作為新型益生菌菌株在有利于腸道健康的產品開發方面的潛力。WANG W W等[20]以清酒乳桿菌作為益生菌P，對從糞便中分離的14株雙歧桿菌進行了抑菌試驗，選擇抑制率為73.75%的雙歧桿菌B10作為益生菌B。此外，與葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）組相比，清酒乳桿菌-雙歧桿菌B10組合物（PB）顯著降低DSS誘導的結腸炎小鼠結腸的表達。目前我國居民應不良的生活習慣和飲食習慣導致居民的抵抗力和免疫力大大下降，因此該研究篩選出的清酒乳桿菌-雙歧桿菌B10組合具有通過免疫調節和腸道微生物群調節緩解腸病，未來可以利用其開發一些益生菌制劑或相關益生菌食品提高機體的免疫力。

2.2.4 抑制病原菌的益生菌篩選

益生菌重要功能性指標之一就是可以抑制病原菌生長，其可通過產生多肽類抗菌物質、有機酸等抑制胺、吲哚等有害物質的產生，從而具有抑制病原菌、緩解炎癥的功效[21]。ANA P等[22]利用從不同食品中分離的280株乳酸菌進行了對幾種食源性致病菌的抑菌活性篩選，結果顯示分離出的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CFF4能夠產生細菌素且在模擬胃腸道傳代后粘附于Caco-2細胞，也能在體外抑制食源性致病菌生長。因其不產生毒力因子和抗生素耐藥性，故是一種潛在的益生菌，可用于食品工業。胡鵬鈺等[23]通過耐酸耐膽鹽能力測試，從母乳中篩選出7株菌株，并對其進行抗生素耐藥性和致病菌抑制能力的測定。結果顯示，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）M53和短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）grx05對3株革蘭氏陽性菌和1株革蘭氏陰性菌有明顯的抑制效果，且有較高的安全性，有希望作為具有益生特性的菌株應用到發酵食品或益生菌制劑開發。

潘浩宇等[24]以瓊脂擴散法作為抑制病原菌的主要篩選方法，選取了不同的糞腸球菌、魏斯氏菌等共計62株菌株進行試驗，結果發現，篩選出的發酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌不僅具有很強的耐酸性，同時在抑菌性上也表現出良好的性狀，顯示出良好的益生菌特性，可以進一步開發應用。朱晶婷[25]對于副溶血性拮抗菌的篩選中，采用點種法從凡納濱對蝦中分離出119株菌株，14株表現出拮抗作用，再通過紙片法進行復篩，得到對副溶血性弧菌具有較好抑制作用的益生菌D9。可以進一步利用該菌株控制水產養殖行業副溶血弧菌的爆發和水產品食源性疾病的預防。趙梓雯[26]對抗鼠傷寒沙門氏菌的益生菌篩選中，通過細胞侵染實驗以及熒光定量研究對鼠傷寒沙門氏菌的致病能力，結果篩選出短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）YH68具有較強的抑制作用，有成為抗生素類替代品的潛力。

2.2.5 抗氧化的益生菌篩選

當體內的氧化應激水平超過身體的抗氧化系統去除活性氧的能力時，就會發生氧化應激。益生菌能有效調節人體內氧化應激的平衡并且具有抗氧化性，但其克服氧化應激的能力和它們所具有的抗氧化機制的水平和類型有關[27]。在ATHINA A等[28]測定了來自不同食品中的乳桿菌菌株在低溫（8 ℃）和暴露于20%～90%濃度的氧氣水平下的抗氧化性能。結果顯示，在8 ℃和20%濃度氧的條件下，乳桿菌菌株生長良好，但大多數菌株不能在高達50%和90%濃度氧的條件下生長。所有菌株的細胞游離提取物均具有一定程度的羥基自由基清除能力和還原能力。陳君[29]從不同來源的食品中分離純化出26株菌進行清除自由基試驗，對初篩出的抗氧化性較高的4株乳酸菌和6株酵母菌進行復篩后，發現其中乳酸菌L1、L2和酵母菌Y3、Y5具有很強的清除超氧自由基、還原能力、抗脂質過氧化能力并在一定程度上延緩小鼠衰老。

2.2.6 促進營養物質消化吸收的益生菌篩選

平衡的微生物群是健康腸道不可或缺的組成部分。腸道中益生菌產生的一些酶和酸性等物質可以有效的幫助消化食物殘渣，促進營養物質的再次吸收利用[30]。DOWARAH R等[31]將36頭斷奶的健康豬仔（28日齡）隨機分為3組，分別飼喂不含益生菌、含嗜酸乳桿菌和乳酸片球菌為基礎的食物。試驗結束時，選取6頭體質量接近的仔豬進行消化試驗，測定養分消化率。結果顯示，與對照組和嗜酸乳桿菌組相比，飼喂乳酸片球菌的豬仔對粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率更好，乳酸片球菌飼喂組紅細胞中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性較高。研究結果表明，篩選出的乳酸片球菌具有潛在的體外益生特性，具有更高的營養物質消化率、血液生化和抗氧化狀態，具有潛在的益生候選能力。

2.2.7 其他功能性益生菌的篩選

益生菌不僅具有強大的腸道功能，還具有其他對人體十分有益的功能。RICHARD N F等[32]通過VSL#3（8種不同益生菌種類的混合物），在回盲結腸切除術和再吻合術后30 d內，隨機給克羅恩病患者1包VSL#3（9 000億活菌，包括1株嗜熱鏈球菌、3株雙歧桿菌和4株乳酸桿菌）或匹配安慰劑。結果顯示與安慰劑相比，接受VSL#3的患者在第90天黏膜炎性細胞因子水平降低，在接受早期VSL#3的患者中具有較低的黏膜水平的炎癥細胞因子和較低的復發率。因此該試驗篩選出的益生菌具有降低炎癥的作用。LIANG C等[33]通過高通量測序對正常體質量和肥胖兒童腸道菌群進行調查，在體外和體內篩選出具有潛在抗肥胖特性的菌株。結果發現，所得菌株表現出明顯的抗肥胖作用，可以進一步用于具有益生菌的減肥產品的開發。BHAGYA H M等[34]從人類初乳中分離的64株乳酸菌被用于進一步篩選細胞外葉酸的生產，結果顯示，4株植物乳桿菌CKR5、CKR8、CKR12和CKR28均能生產葉酸且均具有廣譜抗菌活性，其中CKR8和CKR12還具有抗真菌活性，因此四株植物乳桿菌菌株均具有良好的益生潛力。

3 功能性益生菌在食品中的開發應用

因益生菌具有改善腸道健康、增強免疫系統、可以合成和提高營養物質的吸收利用率等功能，使得益生菌在食品中的應用成為熱門的研發方向。

3.1 含益生菌的乳制品

現在市場上含益生菌的食品最多的是乳制品，乳制品中最常用的益生菌有保加利亞乳桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌等。益生菌影響健康所需的量取決于益生菌種類和菌株以及需要什么樣的健康程度，不同的益生菌起著不同的功效，有些在益生菌的數量達到每天5 000萬個活細胞時有效，而另一些則在超過一萬億個活細胞時有效[35]。

在DOWARAH R等[31]的實驗中篩選出具有促進消化吸收的益生菌有利于益生菌乳制品的開發。馬欣瑩等[36]利用篩選出來的具有降解苯丙氨酸能力的植物乳桿菌YZX21和動物雙歧桿菌F1-7進行生產低苯丙氨酸發酵乳的潛力評價，結果顯示，植物乳桿菌YZX21和動物雙歧桿菌F1-7均具有良好的胃腸道耐受性、自聚集和粘附能力。該研究篩選得到的植物乳桿菌YZX21具有明顯的苯丙氨酸降解活性，而且具有優良的發酵特性與益生特性，為針對苯丙酮尿癥的特醫食品的研究與開發奠定了基礎。LOULOUDA A B等[37]通過實驗研究發現，富含干酪乳桿菌的葡萄干、蘋果片和小麥谷物等物質以新鮮和冷凍干燥的形式摻入酸奶中，可以生產一種新型益生菌乳制品。葡萄干、蘋果片和小麥谷物改善了嵌入的酪蛋白乳桿菌細胞的活力，又由于其持水能力而呈現出較少的脫水作用，具有改善的感官和營養特性。

3.2 含益生菌的果蔬汁

因水果、蔬菜里含有大量的維生素、礦物質、膳食纖維等物質，且此類物質是非常適合益生菌生長的基質，有關益生菌用于加工果蔬汁產品不斷增多，且益生菌飲料生產發酵過程中抗氧化活性增強，提高了飲料的營養價值。在一些益生菌發酵實驗中發現益生菌可以改變果蔬汁的pH值、產生香味成分和各種有利于人體健康的維生素、礦物質等，改善產品的感官品質和營養價值。同時益生菌可以使果蔬汁中少量的酚類結合態轉化成游離態，使酚類的游離態增多，從而可以提高果蔬汁的抗氧化能力[38]。因此未來可以利用益生菌的抗氧化功能更好的應用到益生菌果蔬汁的開發中。

3.3 含益生菌的肉制品

隨著科技的進步，出現了利用益生菌設計新型功能性肉制品的策略，它主要集中應用在發酵香腸上。研究發現傳統的肉類發酵劑中含有乳酸菌和葡萄球菌的混合物，用于保持香腸的安全性和感官特性[39]。CAMILA V B等[40]將篩選出的干酪乳桿菌SJRP66和SJRP169分別添加到低脂發酵香腸中，結果表明益生菌的添加對油脂氧化和產品色度值沒有影響。這些益生菌菌株在低脂發酵香腸中表現出很好的應用前景。發酵香腸的基質結構能夠有效地保護益生菌的生存，具有延續性，但前提是需要益生菌有極強的耐受力來抵制在加工過程中所遇到的高鹽度，低pH等因素[41]。所研發出來的益生菌肉制品不僅具有營養高、利于腸道的消化吸收、具有特殊的發酵風味還具有益生菌特殊的優勢并且能夠長期保藏。

3.4 益生菌制劑

益生菌制劑現如今也已成為熱門的食品產業，發展較快的主要是日本和一些歐美國家。根據益生菌不同功能研發出的益生菌制劑保健品已有上百種，主要是用于改善腸道功能、增強免疫力、改善膽固醇、防止高血壓、預防癌癥等方面，以及改善餐后高血糖和脂肪組織代謝調節碳水化合物和脂質代謝[42]。目前國內的益生菌制劑保健品主要以調節腸道菌群、增強免疫力功能為主，其他應用上較少，且主要的活菌產品類型有粉末型、膠囊型和口服液型等。我國衛生部批準可用于保健食品的益生菌（衛辦監督發〔2001〕84號）主要有：乳桿菌類（保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌等）、雙歧桿菌類（兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等）、革蘭氏陽性球菌（嗜熱鏈球菌）、真菌類（釀酒酵母、紅曲霉等）。后來于2010年（衛辦監督發〔2010〕65號）發布了《可用于食品的菌種名單》，并在隨后幾年以公告形式對名單進行了增補，未來我國益生菌制劑的發展大有前景。

4 總結與展望

我國益生菌行業現如今處于高速發展時期，益生菌在普通食品中的使用越來越多，益生菌產業在快速發展的同時也面臨著一些問題和困難，如益生菌食品缺少標準規范等。雖然目前有大量益生菌食品上市，但部分產品或多或少存在一些問題：如產品里面添加的菌種并非真正意義上的益生菌，可能是益生菌的衍生物等、產品存在摻雜摻假的行為、產品加入的菌種數量不達標等問題。另外益生菌菌種保存過程中會存在一些問題，如活力下降和質量變化等。未來相關科研人員可以進一步挖掘豐富的益生菌資源、開發種類繁多、產品功效明確的益生菌產品，滿足消費者對食品多元化、健康化的需求；可以進一步開展對微生物菌種保藏技術的研究和保護性化合物的開發。相關政府機構對益生菌產業的良好發展進行進一步引導和支持，有必要建立相關的法律法規，同時加大科研投入和產業政策支持，促進益生菌產業的健康發展。