端粒與骨關節炎軟骨細胞衰老的研究進展

劉 浪，趙 雙，張炳華，趙長偉，趙文海

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

細胞衰老這一概念在1961年被海弗利克首次發現并創造，實驗發現體外培養的人類體細胞在有限的傳代后停止復制[1]，這一發現引起了科學界相當大的興趣，并為今后理解衰老背后的細胞和分子特征奠定了基礎。細胞衰老指的是一種高度穩定的細胞周期阻滯，且所有組織類型的衰老細胞都在分子、形態和功能上表現出相似的特征[2]。

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種與年齡相關的慢性疾病，軟骨細胞衰老是其發生的主要危險因素之一[3]，然而，調控軟骨細胞決定衰老的因素仍有待完全闡明。目前的證據表明，細胞衰老與端粒DNA的結構變化有關，且衰老過程中細胞也會經歷獨特的表型改變，其中一個突出的分子現象是衰老細胞中端粒的逐漸縮短[4]，這表明端粒損耗除了是決定細胞預期壽命的一個潛在因素外，也是衰老的標志[5]。因此，越來越多的學者開始關注端粒在軟骨細胞衰老的調控作用。本文重點探討了端粒縮短導致OA軟骨細胞衰老的分子機制，并總結了一些軟骨細胞衰老的主要標志物。

1 端粒的結構和生物學效應

“端粒”一詞來自希臘語，意思是“部分的結束”。穆勒[6]在1938年對果蠅的研究中首次發現端粒的結構，且自端粒發現以來，對它的研究一直未曾間斷。端粒是定位于真核生物染色體末端的DNA-蛋白質結構，人類的端粒主要由TTAGGG的雙鏈重復序列組成，可以保護染色體末端，對維持生物基因組的穩定性至關重要[7-8]。

哺乳動物的端粒是特殊的核蛋白結構，由端粒DNA重復序列和結合蛋白組成，不編碼任何基因產物[9]。端粒的二級結構中有富含G的DNA重復序列和相關蛋白[10]，其中在端粒3'端有一個由G鏈懸垂末端形成的單鏈序列，這個G鏈懸垂折疊形成一個T環（T-loop），隨后侵入5'端DNA雙鏈，形成D環（D-loop）[11-12]，通過這種結構能有效地隱藏端粒的尾部，保護染色體末端不被DNA損傷修復機制識別為DNA雙鏈斷裂，避免了染色體融合的發生[7]。G鏈端粒DNA重復序列也可以折疊成穩定的二級結構即G-四聚體結構（G-quadruplex）[13]，該結構由多個鳥嘌呤堿基對連接在一起，可以導致復制的延遲和基因組的失穩[14]。端粒的另一個大分子成分是長鏈非編碼RNA即TERRA（telomeric repeatcontaining RNA，TERRA）[15]，TERRA 可 以 由 G-四聚體轉錄形成，來源于靠近染色體末端的區域，部分由串聯的UUAGGG重復序列組成，在維持端粒完整性方面發揮著重要作用。Shelterin蛋白復合體是結合蛋白的核心成分，由6個端粒蛋白組成，包括端粒重復結合因子1和2（telomere repeat binding factor 1 and 2，TRF1，TRF2）、端粒保護蛋白 1（protection of telomeres 1，POT1）、POT1結合蛋白1（telomere-binding protein POT1-interacting protein 1，TPP1）、TRF1相互作用蛋白2（TRF1-interacting nuclear protein 2，TIN2）以及TRF2相互作用蛋白 1（TRF2-interacting protein 1，RAP1）[16]，其中任何一種缺失都可能導致端粒功能障礙和細胞衰老的發生。此外，Shelterin蛋白復合體與端粒結構結合，在染色體末端組成一個完整的冒狀結構，以維持端粒長度，調控端粒酶活性[17]。

端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白復合物，其催化核心由端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT） 和 端 粒 酶 RNA（telomerase RNA component，TERC）組成[18]。端粒酶與端粒DNA的3'端結合，并使用其內部TERC作為端粒延伸的模板進行TERT催化的逆轉錄反應，延長端粒[19]。人類的端粒酶僅在胚胎發育過程和高增殖的成年體細胞，如生殖細胞、干細胞和祖細胞中保持高活性，而在體細胞組織中的表達受到抑制[20]，因此，隨著年齡的增長，大多數體細胞組織中的端粒會逐漸縮短，從而導致必然的細胞衰老。

端粒酶復合物是端粒酶激活及端粒延長所必需的，TERT是端粒酶復合物的核心組成部分之一，它通過在端粒前導鏈的3'端添加特定的重復核苷酸序列來延伸端粒。TERT在人類細胞中的轉錄受到多種腫瘤抑制途徑的嚴格抑制，被認為是端粒酶活性的限速器[21-22]。端粒酶復合物的另一個組成部分是TERC，它是一種功能性的lncRNA（long non-coding RNA，lncRNA），作為端粒延伸的模板包含一個與端粒DNA G鏈互補的短片段[23]。此外，TERC在癌癥細胞中的廣泛上調對癌癥的機制研究有重要意義[24]。再者，端粒酶復合物中還存在其他成分，包括角化不良蛋白（dyskeratosis congenita 1，DKC1）、熱激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）、端粒酶Cajal體蛋白1（telomerase Cajal body protein 1，TCAB1）和富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子11（serine and arginine rich splicing factor 11，SRSF11）等[25]，在維持端粒穩態，調節細胞衰老中發揮重要功能[26]。

2 軟骨細胞衰老與OA

細胞衰老最初是指細胞在穩定的培養過程中，由于細胞分裂能力耗盡而進入的一種穩定的細胞周期阻滯狀態[1]，在這種阻滯狀態下細胞停止生長和增殖，但仍保持著活躍的代謝功能，這種復制性衰老的過程也被稱為Hayflick界限[27]。目前，認為細胞衰老是成熟細胞的一種應激反應，他限制了受損細胞的無限增殖，是機體成長發育中不可或缺的過程。然而，各種組織中衰老細胞的積累是引發衰老相關疾病的重要因素[28]。

OA的主要病理特征是軟骨細胞的變性和細胞外基質的降解[29]。軟骨細胞控制著關節軟骨的穩態，它的衰老會導致細胞外基質合成和降解的失衡，也會使軟骨細胞維持和恢復關節軟骨的能力下降[30]。軟骨細胞是稀疏分布于關節軟骨上的一層高度特化細胞，缺乏自我更新的能力，且衰老的軟骨細胞會隨著年齡的增長逐漸積累進而加速OA的發展[31]。目前，軟骨細胞有2種不同的衰老機制：以端粒侵蝕為標志的復制性衰老和應激誘導的過早衰老[32]。軟骨細胞衰老的確切分子機制尚不清楚，但它與炎癥因子、細胞周期阻滯相關基因和軟骨細胞表型維持基因高度相關，如白細胞介素-1β（IL-1β）、p16INK4a、p21、p53、SOX9（SRY-related high mobility group- box 9，SOX9）、骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）等參與誘導軟骨細胞衰老[33]。p53、p21和pRb基因遵循端粒縮短途徑誘導軟骨細胞衰老和凋亡，而p16INK4a通過應激誘導途徑在衰老過程中發揮協同作用[34]。p53是一種典型的腫瘤抑制因子，在大多數腫瘤中并不活躍，但在衰老細胞中上調，p21是p53的第一個下游靶點，它可以阻斷pRb蛋白磷酸化，并可以與E2Fs轉錄因子結合，導致細胞周期阻滯在G1期[35]，而端粒縮短及DNA的損傷也會激活p53，使p21表達增加，從而阻止了細胞周期的進程而引起衰老[36]。此外，表達p53的軟骨細胞與OA的軟骨細胞形態相似，而下調p53的表達則可防止軟骨細胞發生衰老，這表明通過激活p53-p21-pRb通路而實現的細胞衰老可以在隨后的p53失活時被逆轉[37]。另一個與軟骨細胞衰老相關的基因是p16INK4a，表達p16INK4a的軟骨細胞會迅速失去正常的表型，從而表達出更多的炎癥因子和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[38]，p16INK4a還通過阻斷細胞周期蛋白依賴性激酶4和6（cyclin-dependent kinase 4 and 6，CDK4/6） 及 維持pRb、p107、p130的非磷酸化形式，參與G1期的細胞周期阻滯[39]。此外，軟骨細胞衰老也受到多種信號通路的調控，包括p38MAPK、NF-κB通路和Akt信號通路，其中Akt信號的長期激活導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，觸發軟骨細胞衰老并導致OA[40]。

軟骨細胞的端粒縮短會導致OA局部組織發生衰老[41]，而慢性炎癥或氧化應激等刺激同樣可以引起端粒縮短，由于軟骨細胞幾乎不更新，因此應激誘導的端粒縮短比復制性的端粒縮短更有可能發生[42]。衰老細胞的另一個關鍵特征是促炎細胞因子、趨化因子和蛋白酶等數百種因子的釋放，這些因子被稱為衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），可改變周圍組織微環境，抑制干細胞或祖細胞誘導的組織再生，最終導致鄰近細胞的衰老[43]。衰老的軟骨細胞停滯在細胞周期的G1期，此時SASP的積累導致細胞內MMPs增加，使細胞外基質受損而引起組織衰老[42]。研究[44-45]發現，衰老細胞的清除降低了OA中慢性炎癥標志物IL-6和IL-1β的水平，這表明SASP可能是慢性炎癥的部分原因，SASP還可以將衰老的軟骨細胞轉化為促炎細胞，參與到OA的進展中，且清除衰老的軟骨細胞對OA有明顯的防治作用。

3 軟骨細胞衰老與端粒長度

端粒磨損被認為是衰老和導致與年齡相關疾病的重要原因。研究[10]已經證實，端粒長度（telomere length，TL）與一些慢性疾病相關，尤其是以OA為代表的肌肉骨骼疾病。許多動物實驗也表明TL和衰老之間有很強的相關性，端粒縮短的小鼠表現出過早衰老的表型，尤其對細胞周轉率較高的組織器官產生影響，具體表現為脾萎縮、B淋巴細胞和造血干細胞數量減少[46]，而逆轉小鼠端粒的長度可以延長小鼠的壽命，延緩身體的衰老[47]。

人類的TL隨著細胞的復制而逐漸縮短，此時端粒會失去其保護結構和蛋白質，當端粒變得非常短時，細胞將停止增殖并通過DNA損傷途徑觸發復制性衰老，因此TL一直被認為是細胞衰老的標志[2]，而這種不完全的復制并不是端粒縮短的唯一原因。成年人TL的變化很大程度上也歸因于遺傳和環境因素[48]，作為細胞的“分子時鐘”[49]，端粒理論認為，端粒縮短引發的細胞衰老是導致生物老化的觸發因素之一，當端粒縮短到極限長度后，細胞衰老機制被激活，以驅動細胞進入細胞周期阻滯，然而，端粒縮短導致的生物體老化機制仍需要進一步研究。端粒隨著軟骨細胞年齡的增加而縮短，在人類關節軟骨細胞中，端粒縮短的平均速率約為每年40個堿基對，且端粒的變化與復制誘導的衰老樣表型漂移有關[50]。研究發現，軟骨細胞外基質合成下降、相關細胞因子改變和較長的體外增殖時間等軟骨細胞的衰老表型變化早在達到Hayflick界限之前就已經開始出現[51]，這意味著，在連續傳代的軟骨細胞培養達到其復制壽命的相對早期，即端粒磨損到達臨界長度之前，軟骨細胞就已經開始向衰老漂移。

除了復制性衰老誘導的端粒縮短外，應激誘導的衰老同樣可以導致端粒縮短。而軟骨細胞更容易受到如創傷等外部應激源的影響，從而引發過早的衰老。成熟軟骨細胞的端粒縮短可能是由于ROS引起的DNA損傷所致，創傷后的關節負荷、炎癥和持續的氧化應激等刺激會引起軟骨細胞ROS水平增加，導致DNA的氧化損傷，從而誘導染色體末端端粒侵蝕，最終加速軟骨細胞衰老[52]。此外，HARBO等[53]記錄了平均TL和超短端粒（低于1 500個堿基對）與OA嚴重程度和衰老的相關性，發現軟骨細胞染色體端粒縮短與OA的生物學衰老和發病機制呈正相關。

端粒酶活性同樣是影響細胞衰老和細胞復制能力的重要指標。端粒通過阻止染色體末端融合來維持染色體的穩定性，它的復制及延長是一種與基因組復制相協調的復雜機制，需要一種特殊的逆轉錄酶即端粒酶參與。然而，端粒酶只在胚胎干細胞及某些免疫系統細胞中活躍，在大多數體細胞中沒有端粒酶表達的情況下，端粒隨著每一輪復制而縮短，當端粒縮短達到臨界值時將被識別為雙鏈DNA斷裂，且端粒酶的活性會隨著時間的推移而耗盡，使端粒侵蝕更容易發生[54]。此外，成人軟骨細胞中的端粒酶含量及活性并不能延長細胞的復制壽命，即使酶的活性水平足以防止端粒侵蝕[55]。軟骨細胞端粒酶的缺失與OA的發展密切相關，對馬關節軟骨細胞端粒酶的分析表明，隨著年齡的增長，端粒酶活性降低，且青春期前的馬存在端粒酶活性，青春期后則不存在端粒酶活性，這意味著軟骨細胞的端粒侵蝕、衰老和對OA易感性開始于青春期的結束[56]。端粒酶會優先延長最短的端粒，以防止DNA突變、重排或融合，這是維持長期基因組穩定性所必需的[57]。端粒酶也可用于OA的治療，OA進展時會使細胞出現不可逆的衰老或死亡，而端粒酶可以刺激足夠數量的細胞生長，對抗疾病[58]。

端粒酶隨著年齡的推移而逐漸減少所導致的端粒縮短是細胞衰老最具代表的特征，因此端粒酶可以做為維持TL和延緩軟骨細胞衰老的重要靶點。MARTIN等[59]通過對衰老軟骨細胞的研究證實了用TERT轉導的軟骨細胞能夠刺激端粒酶的活性，增加TL，從而延長細胞的壽命，提高關節軟骨的修復能力。事實上，OA患者的軟骨細胞在外源性端粒酶逆轉錄病毒的轉導下可以使細胞的壽命得到延長，這意味著端粒酶的外源性表達在軟骨細胞增殖和特異性表型的維持上有著巨大潛力[60]。

4 軟骨細胞衰老的主要標志物

4.1 SIRT6

沉默信息調節因子6（silencing information regulator 6，SIRT6）是位于細胞核的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的組氨酸去乙酰化酶Sirtuins家族成員之一，參與了一系列生物過程，主要包括DNA修復、端粒維持、細胞衰老和炎癥[61-62]。SIRT6是人類軟骨細胞衰老過程的關鍵調節因子[63]，它的活性隨年齡和與衰老相關的氧化應激條件而改變，并且SIRT6的過表達可以特異性增加過氧化物還原酶1（peroxiredoxin 1，Prx1）和硫氧還原蛋白（sulfiredoxin，Srx）兩種抗氧化蛋白的水平，以維持軟骨細胞的氧化還原穩態平衡[64]。最近的一項研究發現，SIRT6在預防代謝綜合征引起的關節軟骨降解和髕下脂肪墊炎癥上有著重要作用，為探索OA的作用機制提供了方向[65]。

4.2 MMP13

促炎細胞因子誘導的MMP13積累同樣是OA軟骨細胞衰老的重要中樞調節因子[66]。MMP13是MMPs家族的一員，在人類OA軟骨細胞中高度過表達，并在軟骨聚集蛋白聚糖的降解中發揮重要作用，是OA進展的主要膠原酶[67]。軟骨II型膠原是構成大多數細胞外基質的主要成分，衰老中的軟骨細胞會產生較多的MMP13，同時促進II型膠原和聚集蛋白聚糖等關節軟骨的主要蛋白降解[68]。MMP13長期以來一直被認為是軟骨侵蝕的主要酶，同樣也是軟骨細胞SASP中的一員，且MMP13的分泌還與軟骨細胞合成代謝和分解代謝的平衡功能有關。

4.3 SA-β-Gal

自1995年，DIMIRI等[69]在pH為6時檢測到衰老細胞表達的衰老相關-β-半乳糖苷酶（senescenceassociated β-galactosidase，SA-β-Gal）時起，它就已經成為應用最廣泛的衰老細胞生物標志物。溶酶體β-Gal是SA-β-Gal活性的來源，在衰老細胞中檢測到的SA-β-Gal活性的增加顯然是溶酶體酶編碼基因GLB1表達增加的結果[70]。SA-β-Gal活性易于檢測和觀察，傳統上，SA-β-Gal活性使用5-溴-4-氯-3-吲哚 -β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside，X-gal）作為底物進行細胞化學檢測時可觀察到不溶的藍色化合物[71]。

在OA病變附近的軟骨細胞中，SA-β-Gal的活性水平與疾病的嚴重程度呈正相關[72]。CHUNG等[73]研究發現，SA-β-Gal活性在低劑量砷暴露誘導的人軟骨細胞和大鼠關節軟骨中均顯著增加。盡管如此，一些研究已經發現，以SA-β-Gal活性標志的衰老也存在局限性，例如，在pH為6時的β-GAL活性也可能反映了自噬的活性[74]。因此，為了確定細胞的衰老，仍然需要補充其他標記物。

4.4 其他

衰老相關基因（p16INK4a、p53）的表達是評估細胞衰老的重要標志，其中，p53是衰老程序的核心組成部分，在軟骨細胞衰老過程中p53的表達和乙酰化增加[75]。p16INK4是軟骨細胞功能障礙的生物標志物，在小鼠軟骨和體外原代人類軟骨細胞中，p16INK4的表達隨著年齡的增長而顯著上調[76]。此外，除了軟骨細胞，在OA滑膜成纖維細胞中p16INK4的表達上調也提示著滑膜成纖維細胞已衰老[77]。

細胞通訊網絡因子3（cellular communication network factor 3，CCN3）又稱為腎母細胞瘤過表達 因 子（nephroblastoma overexpressed，NOV） 是CCN家族的經典成員之一，參與軟骨內成骨、軟骨發育、分化和代謝調節等多種生理功能[78]。CCN3可以作為軟骨細胞衰老的一個新的標志物，在衰老小鼠和人類關節軟骨中的表達上調，并且通過誘導p53和p21來加速細胞衰老[79]。再者，酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）在軟骨細胞衰老過程中是一種至關重要的抗衰老因子。KIM等[80]研究發現，抑制CK2的活性可誘導原代關節軟骨細胞的衰老，且抑制CK2介導的衰老與軟骨細胞中血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達調控有關。

5 小結

世界各地老年人口數量的迅速增加給慢性疾病的醫療保健服務帶來了越來越大的壓力，這一人口趨勢強調了從細胞和分子水平上研究衰老的迫切需求。OA是最常見的慢性疾病，具有較高的發病率和致殘率。軟骨細胞衰老在OA的發生發展中起到直接的作用。衰老是細胞應對分子損傷的一種防御機制，能防止受損細胞或應激細胞的增殖，從而維持機體穩態。近年來對軟骨細胞衰老的研究有所擴大，特別是在衰老調節機制和相關衰老標志物方面。

端粒磨損和功能障礙長期以來一直被定義為衰老的標志，是正常衰老和許多應激誘導過早衰老的共同特征。越來越多的證據表明，端粒縮短與軟骨細胞衰老和OA的發病機制密切相關。本文綜述了端粒的生物結構和端粒縮短在OA軟骨細胞衰老過程中的機制。軟骨細胞的衰老還涉及多種復雜的信號通路和生物過程，因此篩選出在調節軟骨細胞衰老中發揮關鍵作用的標志物將有利于闡明軟骨細胞衰老的分子過程。

綜上所述，軟骨細胞衰老是一個復雜的現象，其中端粒縮短是導致其衰老的主要原因，因此延長端粒或減緩端粒縮短可能是抗衰老的重要干預靶點。衰老細胞的增加和炎癥同樣在軟骨細胞衰老過程中起著突出的作用，所以清除衰老細胞和減少SASP也是抗衰老的重要策略。此外，為了更好地了解端粒對軟骨細胞衰老的影響，還需要在分子水平上進行更多的研究。