葡萄糖-黃連素納米顆粒抑制腦膠質瘤的價值

郝志強 王樹斌 朱 巍

黃連素又叫鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride，BBR)，它是從清熱解毒中藥黃連及小檗堿屬植物中提取分離得到的一種異喹啉類生物堿，在傳統中醫藥中廣泛應用于大腸濕熱，赤白下痢，里急后重或暴注下瀉，肛門灼熱等。隨著現代藥理學研究發現，BBR具有調節免疫、消炎、殺菌、降壓、降糖、抗血小板聚集以及抗腫瘤等作用，故臨床上可用于腸炎、心血管疾病、糖尿病以及惡性腫瘤等疾患[1]。特別是在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、腸癌、黑色素瘤和神經膠質瘤的研究中發現，BBR通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、阻止腫瘤細胞遷移和浸潤、增加腫瘤細胞對放療射線的敏感度以及為化療藥物增敏等方面達到抗腫瘤的作用[2,3]。

一、黃連素的抗腫瘤機制以及給藥途徑

黃連素的具體抗腫瘤機制可能體現在以下方面，BBR通過復雜的信號通路抑制多種腫瘤細胞的惡性增殖，但對不同的腫瘤細胞的作用特點也不完全相同，例如在細胞周期方面，BBR能使分裂的細胞停滯于G0/G1期，抑制DNA合成[4]。另有研究表明，BBR通過影響p21蛋白表達，阻滯腫瘤細胞于G2/M期，提高放化療的敏感度，同時通過有絲分裂危象途徑殺滅腫瘤細胞；也有文獻報道，BBR可以直接殺死腫瘤干細胞[5]。此外，既往研究顯示，BBR可通過抑制缺氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的表達來抑制腫瘤血管形成，阻斷腫瘤細胞、血管內皮細胞及胞外基質之間的黏附等多種途徑抑制腫瘤的生長，但其是否可以通過表觀調控來影響腫瘤侵襲或血管新生等方面尚無系統報道。

BBR給藥途徑的差異能導致吸收率的顯著差異，在大鼠的多途徑BBR給藥模式研究(如口服、腹腔注射、尾靜脈注射等)中發現，口服途徑最為安全，無半數致死量(LD50)，腹腔注射次之(LD50為57.6103mg/kg)，靜脈給藥有著較低的LD50(9.0386mg/kg)，伴隨大鼠心率的降低[6]。在200mg/kg BBR口服給藥后，結合液相色譜串聯質譜(liquid chromatography-mass spectroscopy/mass spectroscopy，LC-MS/MS)技術，發現BBR快速分布到肝臟、腎臟、肌肉、肺、腦、心臟、胰腺等組織，在隨后的4h，BBR能穩定滯留于肝臟、腎臟、腦和胰腺組織，并伴隨4種代謝物的產生[7]。在BBR處理的小鼠、大鼠和家兔中都均沒有出現急性毒性，藥代動力學及對血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)的通透性的研究中發現，BBR對血-腦脊液屏障的通透有兩個方向，即從血液循環入腦以及從腦到外周循環。然而，這兩個方向存在著顯著差異，藥物血液循環入腦(靜脈給藥)比從腦擴散到外周循環(腦室內注射)困難得多，從而表現為BBR在腦組織內的累積。而關于BBR是否能直接穿透血-腦脊液屏障，少數研究認為,BBR可以透過BBB，但缺乏對相應的機制的進一步研究[8]。

二、惡性腦膠質瘤的治療現狀和瓶頸問題

腦膠質瘤發生率約為12/10萬，約占顱內所有腫瘤的49%，大部分為惡性表現，容易發生腫瘤播散及復發，且有難治性的特點，惡性腦膠質瘤的5年生存率為6%[9]。腦膠質瘤在腦實質內呈彌漫浸潤性生長，肉眼很難分辨腫瘤的組織學邊界，且由于腦功能區的限制，僅依靠經驗和肉眼判斷，切除程度難以完全切除腫瘤[10]，臨床上一般手術切除不會超過影像學上所見的腫瘤邊界。因此，盡管顯微手術技術在不斷進步，但切除術后早期復查腦MRI結果提示仍有約40%的腦膠質瘤存在殘留表現。目前臨床上仍然無法通過影像學技術來有效地確定腦膠質瘤的具體邊界，腦膠質瘤播散、侵襲的規律也無規律可循；在局部放射治療方面，腦膠質瘤的放射致死量顯著高于正常腦組織的耐受量，所以腫瘤區域局部加量也無法達到腫瘤的放射致死量，不能有效殺滅腫瘤。

血-腦脊液屏障是動物神經系統中由毛細血管壁與神經膠質細胞緊致相連而形成的血漿與腦細胞組織間的屏障，以及由脈絡叢形成的血漿與腦脊液間的屏障，血-腦脊液屏障作為腦和脊髓內的一個動態的調節界面，為大腦和脊髓維持一個相對穩定的內環境。在臨床治療中，很多藥物不能透過BBB，這也是造成中樞神經系統疾患用藥在給藥途徑上的一個瓶頸。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是目前腦膠質瘤治療的一線標準口服烷化劑，TMZ的耐藥是造成腦膠質瘤化療失敗的主要原因之一，腦膠質瘤化療耐藥的原因是多方面因素共同作用造成的結果，是一個十分復雜的互相作用的生物學過程，近年來，在腦膠質瘤藥物治療方面選擇TMZ和生物靶向藥物聯用是比較活躍的一個研究領域，聯合用藥可能提高抗腫瘤療效并且降低患者的毒性反應。另外，由于解剖結構、神經功能和放射抵抗等因素的限制，腦膠質瘤局部治療的手段難以完全控制腫瘤，治療效果差，復發率高。臨床上，腦膠質瘤的治療仍然難以取得令人滿意的效果，尋找新的藥物和靶向治療手段是目前的熱點。

近年來，隨著醫學科技的大踏步前進，學科之間甚至不同領域的相互交叉融合，尤其是多學科協同理念的不斷強化以及實踐，腦膠質瘤的臨床治療方法呈現多樣化且相關技術均有顯著的進步，目前已形成了以手術切除為主，聯合放化療、靶向治療、免疫治療等其他方法的綜合治療體系，也不乏有尚在實驗研究階段的中樞神經系統靶向給藥的方法，包括頸內動脈注射高滲性藥物，靶向單克隆抗體偶聯藥物后系統途徑給藥，腦內直接注射給藥，脂質體技術包載藥物以增加腦脊液中的藥物濃度，病毒載體介導基因后直接腦內注射，利用緩激肽拮抗劑或者穿膜肽促使毛細血管內皮細胞膜性改變BBB的通透性。但是這些方法均有其不足，表現在制備工藝太復雜；中樞神經系統對脂質體的攝入特異性較差，導致其他正常組織器官分布較多及其相應的不良反應；病毒載體介導基因和腦內注射方式也存在安全隱患。

針對惡性膠質瘤的靶向藥物在體內的輸送是一個級聯過程，納米載體需要連續突破多重的生物屏障才能達到輸送的高效性，才能進一步提高納米藥物的治療效果；藥物在血漿中長時間保留可以實現在顱內腫瘤組織中的富集以進一步提高濃度取得更好的療效；克服腫瘤周圍的腫瘤組織代謝環境(血-腫瘤屏障)的阻礙(由組織缺氧、酸中毒、間質高壓，以及產生的大量生長因子和蛋白水解酶，免疫炎性反應等形成)，滲透到腫瘤組織中的每個部分以作用于所有的腫瘤細胞，快速地進入到各個腫瘤細胞，并且在細胞內將藥物快速釋放以期充分達到抗腫瘤作用。若需實現上述多級連續的過程，目前已有的功能單一的載體材料是難以實現的，這就需要進一步根據藥物輸送過程中關鍵屏障的性能和特點，來設計相對應的性能的材料，多項功能協同克服上述藥物輸送過程中的各種生物屏障。

三、納米技術在黃連素中的應用

隨著科技的發展，納米材料由于其獨特的理化和生物性質在藥物制備中產生越來越廣泛的應用[11]。近期初步研究顯示，納米藥物分子與傳統的腫瘤化學治療藥物比較，具備其獨有的生物特性，比如：納米顆粒可以更好地通過生物體內的各種生理屏障，從而充分進入循環系統，納米藥物分子的靶受體可能與傳統的腫瘤化學治療藥物的受體不同；特定大小的納米材料可通過逃避機體免疫系統的攻擊，增加了它在體內的半衰期；同時，納米材料所產生的被動靶向效應可實現對腫瘤部位的靶向效果。這表明納米藥物的殺傷以及抑制腫瘤的具體機制可能不同于傳統化學治療藥物的具體機制。腦膠質瘤由于血-腦脊液屏障的存在，導致水溶性藥物透過率低，難以在膠質瘤內形成有效的血藥濃度。

納米材料是利用納米顆粒的小尺寸以及表面效應來改善機體對藥物的吸收效果且同時可以達到人工控制藥物的釋放的效果[12]。通過藥物的納米化組裝，提高藥物穿過血-腦脊液屏障的能力，更改其布局，提升其生物利用度等，所以納米化藥物可以在顱內更好地發揮療效。與傳統的化療藥物比較，納米化藥物可以提高穩定性以及靶向性。對擬設的組織、器官具有靶向作用，而且可以更好地進入靶細胞或細胞器中，納米化藥物濃聚于靶細胞更加提高了治療效果，也可以顯著減輕因藥物分布廣泛而引起的相關不良反應[13]。這正是臨床中應用毒性不良反應較大的抗腫瘤藥物所期待的途徑，所以對于腦膠質瘤的治療納米化藥物具有顯著優勢。直徑為30～100nm的納米顆粒的相關理化、生物性能優越，容易于機體內形成長循環系統，可以更加有效地通過血-腦脊液屏障，進入中樞神經系統，達到更好的靶向給藥效果。

葡萄糖包被的黃連素/鹽酸小檗堿納米顆粒(glucose-coated berberine nanopartical，BBR-Glu NP)粒徑為238nm,較BBR-Water的475nm有顯著的生物學優勢。腫瘤生長需要消耗大量的能量和氧氣，腫瘤的失控性生長使腫瘤細胞的增殖能力遠遠超過了為其供應能量的滋養血管的增殖能力，能量供應相對不足，而且腫瘤細胞在有氧的條件下，也主要是以糖酵解途徑獲得能量，導致葡萄糖大量的消耗，而ATP的生成仍不能滿足自身的需要。因此，腫瘤細胞需要通過葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter，GLUT)的高表達，促進細胞內葡萄糖轉運且可以促進糖代謝，以維持腫瘤細胞基本的葡萄糖代謝順利進行。

腫瘤細胞和血-腦脊液屏障的葡萄糖轉運蛋白表達明顯高于正常細胞，一些證據表明，GLUT1/3能夠介導葡萄糖包被的納米顆粒穿過血-腦脊液屏障和血-腫瘤屏障[14～17]。GLUT1/3主要是依靠細胞膜內外葡萄糖的濃度差將其由細胞外轉運到細胞內。葡萄糖包被的納米金、氧化鎂、鐵等納米顆粒已經顯示出對腫瘤獨特的靶向性，尤其是葡萄糖包被的金納米顆粒已經證實可以通過血-腦脊液屏障[18～21]。一般而言，腫瘤細胞的生長較正常細胞均旺盛，其能量來源主要為葡萄糖的酵解，葡萄糖包被的納米顆粒有望通過葡萄糖的轉運途徑進入細胞內，對代謝活躍的腫瘤具有更好的組織靶向性[22]。前期工作發現，BBR-Glu NP對腦膠質瘤細胞的線粒體有獨特的親和性，線粒體既是細胞能量代謝的主要環境，又可以促進細胞的凋亡，會在能量代謝途徑影響腫瘤的惡性行為。BBR-Glu NP可過線粒體途徑影響腦膠質瘤細胞的能量代謝，ROS聚集，線粒體嵴結構的破壞甚至消失，以及促進細胞G2/M期阻滯與細胞凋亡。同時，BBR-Glu NP對腦膠質瘤U251和U87 G2/M期阻滯，將對放射治療具有潛在的增敏作用，可能通過有絲分裂危象提高腦膠質瘤的放療敏感度。鑒于BBR-Glu NP對中樞神經系統腫瘤作用機制的研究還未見報道，因此，探索BBR-Glu NP在腦膠質瘤的靶向治療方面具有一定的臨床意義。

四、展 望

葡萄糖包被的黃連素混合納米顆粒較水溶性黃連素具有更好的藥物攝入量和細胞殺傷性，而且體外實驗已顯示出葡萄糖包被的黃連素/鹽酸小檗堿混合納米顆粒可以通過線粒體代謝途徑引起腦膠質瘤細胞生長抑制、周期阻滯、凋亡增加，但是仍有很多問題有待于進一步研究了解，比如該納米藥物是否能夠有效透過血-腦脊液屏障，通過血-腦脊液屏障后該藥物是否能夠準確靶向至原位腦膠質瘤模型，同時該藥物是否確實能夠協助增強放化療敏感度等方面仍缺乏相應的研究。該藥物的相關藥物實驗若能證實上述機制，將為腦膠質瘤的治療帶來革命性的成果，甚至可以延伸至其他惡性腫瘤的治療領域，同時也將進一步為中藥抗腫瘤基礎研究添磚加瓦，因此，探索新型納米藥物的制備在腦膠質瘤治療中具有潛在的臨床意義。