生物活性絲素蛋白敷料在創面修復中的研究進展

管 彤, 張 鋒

(蘇州大學 a.紡織與服裝工程學院; b.現代絲綢國家工程實驗室,江蘇 蘇州 215021)

皮膚作為人體最大的器官除了具有感受、分泌、排泄、呼吸等功能,在保護人體免受環境、脫水和傳染源侵害方面也起著至關重要的作用[1]。外力、高溫、疾病及化學腐蝕可能會破壞皮膚的完整性,造成傷口感染、組織損傷及功能喪失,嚴重情況下更會危及生命,因而皮膚創傷的有效治療十分重要。基于組織工程原理引入的傷口敷料可以有效改善臨床組織修復效果,在促進傷口修復的同時有效減少疤痕的出現。理想的敷料應具有以下特點:1) 具有一定的柔韌性和強度;2) 透氣且不會引起免疫反應,并可抵抗外界微生物的入侵;3) 能在傷口界面保持溫和濕潤的環境[2]。

絲素蛋白是一種源于蠶絲去除絲膠的兩親性天然高分子材料,由18種氨基酸組成,其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸是其主要組成部分,占總氨基酸含量的75%左右。其一級結構主要由Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser六肽重復序列與非重復序列相間分布而成[3],二級結構主要為Silk Ⅰ和Silk Ⅱ。其中,Silk Ⅰ由無規卷曲和α-螺旋交替堆疊而成,Silk Ⅱ主要由反平行β-折疊組成。研究表明,絲素蛋白結構與其材料性能密切相關,因此可以通過結構調控絲素蛋白材料的降解、力學、生物相容性等性能[4]。

蠶絲作為醫用縫合線的使用已有幾十年的歷史,因其優良的打結性能而深受臨床醫生的認可與歡迎。隨著對蠶絲結構特征與物化性質研究的深入,其在生物醫學領域的應用受到越來越多的關注。絲素蛋白經再生加工后可以形成薄膜、多孔海綿、水凝膠、納米纖維膜等支架,更好地滿足各種組織修復的需要。絲素蛋白的高透氣率和高吸氧率、優異的機械性能、良好的生物相容性、可降解性、易于塑形等特點,使其在創面修復領域中受到研究者的青睞。近年來,絲素蛋白敷料被成功開發,并被中國批準用于臨床創面修復。為加速創面愈合,提升創面修復效果,通過絲素蛋白材料結構性能設計與優化,或與活性因素結合用于創面修復的研究取得了重要進展。本文綜述了絲素蛋白作為創面敷料的功能特性,并重點闡述活性絲素蛋白敷料在創傷修復中的研究現狀與進展。

1 絲素蛋白的生物學特性

1.1 免疫反應

植入生物材料應盡量避免或減少免疫和組織反應的發生。大量的體外與體內實驗表明,絲素蛋白具有較低的免疫原性和組織反應性。這種低免疫反應表現為不易激活免疫細胞(如巨噬細胞)、不引起炎癥因子釋放、較低的體內排異反應等。絲素蛋白在植入體內的初始階段會引起輕度的炎癥反應,有利于破壞損傷部位存在的病原體,促進機體的生長因子釋放,有助于傷口修復。Panilaitis等[5]研究了巨噬細胞對絲素的反應,表明絲素的低炎癥潛能是基于促炎細胞因子TNFα的釋放。絲素蛋白在植入初期的炎癥反應會很快消退,不存在發展為慢性炎癥的風險[6]。絲素蛋白中富含的氨基酸能夠激活巨噬細胞JNK-STAT信號通路,介導巨噬細胞發生M2極化行為,從而降低植入部位的炎癥反應[7]。Rnjak-Kovacin等[8]發現,與2周相比,4周后皮下植入的絲素蛋白多孔支架內浸潤的免疫細胞顯著減少。絲素蛋白水凝膠皮下植入2周內可見巨噬細胞和中性粒細胞,4周后這些免疫細胞急劇減少,12周后免疫細胞消失[9]。因此,作為一種低免疫反應的生物材料,絲素蛋白材料體內植入后可以為宿主組織修復提供支持。

1.2 止血性能

生理性止血主要由血管收縮、血小板血栓形成和血液凝固三個過程組成。止血材料的止血機制是在血管收縮的基礎上,通過血小板黏附與聚集、凝血因子濃縮實現快速高效止血的效果。作為一種生物材料,絲素蛋白本身即具有一定的止血功能。絲素蛋白通過溶解或溶脹黏附于傷口并物理封閉創面,從而達到止血作用。絲素蛋白還可以吸附并濃縮血液中的有效成分,如凝血因子、血小板等促進止血過程。此外,絲素蛋白直接激活凝血因子或血小板進而激活凝血系統,通過血栓發生達到止血效果。溫壯壯[10]利用核黃素交聯形成非晶高溶脹絲素蛋白水凝膠,利用高溶脹特性快速封堵創面血管。Kundu等[11]研究發現絲素蛋白可以顯著縮短凝血時間,與明膠相比可以縮短50%左右,深入分析發現絲素蛋白通過活化血小板發揮促凝活性。Teuschl等[12]將纖維蛋白原、凝血酶與蠶絲溶液混合形成的活性絲素蛋白材料實現了快速高效止血,從而加快傷口愈合。因此,為了進一步提高絲素蛋白的止血性能,可以通過絲素蛋白結構設計、多成分復合、凝血因子負載等實現。

1.3 再上皮化

再上皮化是皮膚傷口愈合極為重要的一個環節,主要包括角質形成細胞的遷移、增殖和分化三個階段。已有研究證實,絲素蛋白可促進成纖維細胞纖連蛋白和血管內皮生長因子的表達,激活NF-κB信號通路,促進傷口再上皮化,從而誘導傷口愈合[13]。絲素蛋白中存在促上皮化的活性物質,Abdel-Naby等[14]使用含有可溶性絲素蛋白的滴眼液治療兔角膜上皮損傷,研究結果顯示,顯著提高了上皮細胞增殖、角膜上皮損傷的快速愈合及角質上皮再生。因此,絲素蛋白優良的生物性能為細胞提供了一個良好微環境,有助于角質形成細胞的遷移,促進傷口的早期再上皮化,減少傷口愈合的時間。

1.4 血管新生

血管生成是創面愈合的必要條件,因此促進血管新生成為生物醫用材料研究與開發的熱點之一。為了促進血管化,生物材料須具備適宜的成分、形態、結構與力學性能。絲素蛋白膜對全皮層缺損有較好的修復效果,顯示了較好的血管化作用[15]。現有多項研究證明,絲素蛋白通過促進血管新生加速了傷口愈合。Samal等[16]的體外細胞實驗證明,共培養在絲素蛋白三維支架上的人內皮細胞和包皮成纖維細胞可以形成血管樣結構。Stoppato1等[17]將絲素蛋白纖維混入聚乳酸鹽浸海綿支架后,發現該復合支架不僅更有利于體外內皮細胞的生長,而且促進了體內的血管化進程。Chouhan等[18]將絲素蛋白水凝膠用于燒傷創面,發現絲素蛋白水凝膠與未經治療的傷口相比,其血管密度高出10倍。Wang等[19]研究發現,絲素蛋白中混合絲膠蛋白可以通過激活巨噬細胞,特別是提高M2型巨噬細胞的比例以促進血管化。因此,絲素蛋白作為一種生物材料,具有促進毛細血管生成的特性,有利于其在創面愈合中的應用。

2 生物活性絲素蛋白材料敷料

2.1 純絲素蛋白敷料

絲素蛋白具有良好的生物相容性,但缺少生物活性,這限制了其在生物醫學領域的應用。針對目標組織的結構特征,通過材料的結構與性能設計可取得更好的修復效果,如取向結構用于神經修復[20]、高壓縮模量用于骨組織工程[21]。在創面修復方面,絲素蛋白支架的結構設計與性能調控同樣可發揮積極作用。Lu等[22]對自組裝絲素蛋白納米纖維進行電場處理,制備了各向異性的絲素蛋白納米纖維多孔支架,研究發現支架的各向異性結構可提高細胞的遷移效率,促進組織向內生長、表皮新生、膠原沉積,以及更快的傷口閉合。Wrayls等[23]采用微加工和軟光刻技術在絲素蛋白支架內引入微通道來模擬微血管分布,體外細胞實驗結果發現這些微通道促進內皮細胞增殖、VEGF分泌及血管樣結構形成,這些體外形成的血管樣結構體內植入后與宿主血管吻合,加速血管浸潤,為移植干細胞與組織生長提供及時和充分的營養物質。

支架力學性能是影響細胞功能與組織再生的一個重要因素,有研究認為壓縮模量為1～7 kPa的材料更有助于血管形成[24]。Han等[25]通過添加酸來調節絲素蛋白的自組裝結構,得到了水不溶且壓縮模量為5 kPa左右的支架,研究發現該支架在不添加生長因子的情況下可以體外促進干細胞向內皮細胞分化,體內促進血管新生和組織生長,成為一種具有促進血管化性能的活性絲素蛋白支架。與以往的研究不同,該納米纖維支架主要由Silk Ⅰ結構組成,具有柔軟的力學性能和促血管化能力。為了更精確地調控絲素蛋白支架力學性能,Lu等[26]將結晶與非晶的絲素納米纖維混合,再結合冷凍溫度控制絲素二級結構,成功將絲素支架力學性能調控為3～7 kPa,并發現機械強度為5.7 kPa的支架促血管化性能最佳,然而其韌性未能滿足應用需求。Guo等[27]結合冷凍溫度和有序結構雙因素制備了力學性能為2 kPa和5.9 kPa的絲素支架,增強了材料的韌性,研究發現5.9 kPa的絲素支架具有更好的促血管化性能,同時可促進細胞的遷移與增殖。因此,通過取向結構設計、微通道整合、力學性能優化來提升絲蛋白支架的活性,具體表現為促進細胞增殖與遷移,促進血管樣結構形成與血管新生等,從而提升創面修復效果。

2.2 絲素蛋白復合敷料

純絲素蛋白材料在創面修復中存在成分、結構、性能方面的不足,通過與天然或合成高分子材料復合可以賦予材料更多潛能[28]。殼聚糖是一種堿性、帶正電荷的天然多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性和抗菌能力,被廣泛應用于皮膚組織工程。采用靜電紡絲制備的絲素/殼聚糖二維復合納米纖維膜不僅具有良好的抗菌性能,而且更有利于人角質細胞的黏附與鋪展[29]。在形成自組裝絲素納米纖維的基礎上,Ding等[30]利用冷凍干燥技術制備了在成分與納米結構方面雙仿生的復合支架,該復合支架在體外可以促進干細胞增殖,體內促進血管新生與組織長入。此外,除了原材料復合,還可通過支架表面修飾優化其性能。Guang等[31]在多孔絲素蛋白支架上涂敷殼聚糖制備的復合支架,實現了無疤痕無感染的大鼠創面修復。

角蛋白、聚乙烯醇、海藻酸鈉、蘆薈膠、膠原蛋白、透明質酸等與絲素復合后均對傷口愈合起到促進作用。Bhardwaj等[32]采用冷凍干燥制備了絲素蛋白與人角蛋白三維復合支架,研究發現角蛋白的加入提高了絲素蛋白支架的力學性能,同時促進成纖維細胞的黏附與增殖,特別是促進細胞分泌更多I型膠原。絲素蛋白與彈性蛋白的復合可以更好地模擬細胞外基質結構與性能,該復合支架支持人皮膚成纖維細胞的正常增殖,促進三度燒傷創面的快速愈合,效果與商業用膠原膜相近[33]。海藻酸鈉與彈性蛋白相比,不僅能快速吸收水分并維持濕潤密封環境,還具有清潔傷口的作用,避免傷口感染發炎。基于絲素蛋白與海藻酸鈉的復合支架,發現可以通過上皮細胞的快速增殖促進大鼠傷口愈合,取得了與臨床用敷料相近的傷口愈合效果[34]。以上研究表明,基于絲素蛋白制備的復合支架具有更加優良的結構性能與生物學特性,適合用于創面組織修復。

2.3 絲素蛋白負載生長因子

創面修復是一個復雜的生物學過程,涉及多種生長因子的參與和調控,如表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)等[35]。通過在絲素蛋白支架上負載生長因子可以賦予支架更多生物活性,從而實現更好的創面修復效果[36]。

VEGF是急性創面愈合早期必需的生長因子之一,在肉芽組織中通過毛細血管增殖提升再內皮化的速度[37]。Song等[38]采用新型的輪紡技術制備了負載VEGF的海藻酸鈉和絲素蛋白復合纖維材料,研究發現基于溶液濃度與纖維形態的設計可實現VEGF的可控釋放,該材料有望用于創面治療。EGF不僅可以誘導角質形成細胞的遷移和上皮化,還可以產生細胞因子和膠原蛋白,保持皮膚的拉伸強度[39]。通過靜電紡絲技術制備出的絲素蛋白納米纖維材料對生長因子有著很好的親和性,有利于生長因子的負載。Chouhan等[40]采用靜電紡絲技術開發了EGF和鹽酸環丙沙星功能化的絲素蛋白敷料,體外細胞實驗表明該敷料可促進成纖維細胞和角質形成細胞的增殖,體內創面經敷料覆蓋后可促進皮膚細胞外基質中成熟彈性蛋白、膠原蛋白和網狀纖維的沉積,實現創面無疤痕愈合。

單因子裝載難以應對創面復雜的微環境,如糖尿病慢性難愈創面仍是臨床難題。Chouhan等[41]采用靜電紡絲技術將含有RGD序列的柞蠶絲和聚乙烯醇加工成納米纖維膜,并負載兩種生長因子(EGF和bFGF)及抗菌肽(LL-37),體外細胞實驗發現該支架可顯著提高細胞遷移效率,體內糖尿病皮膚缺損實驗證明該支架支持更快的肉芽組織發育、血管生成和再上皮化。此外,在復合支架中發現有組織結構的細胞外基質沉積(I型膠原、III型膠原、彈性蛋白、網狀蛋白)和更高的傷口斷裂強度。由于生長因子對組織生長的強調節作用,其在絲素蛋白支架上的負載可以取得即時的生物學效應,因而成為提高絲素蛋白生物活性及創面修復效果的有效策略。

2.4 絲素蛋白負載藥物

暴露的創面不僅面臨復雜的體內微環境,同時面臨體外環境干擾,藥物的使用可以更好地促進創面愈合。絲素蛋白除了擁有良好的生物學特性,還是優異的藥物載體,可以更好地保持藥物活性并實現藥物的精準遞送[42]。例如,與以溶液和粉末形式相比,青霉素和四環素等抗生素載于絲素蛋白膜中表現出更高的穩定性[43]。

創面愈合是一個復雜的過程,即使傷口愈合之后仍然有可能形成嚴重的疤痕,對患者的外貌心理皆易造成影響,為了解決這一問題,可在敷料上負載針對性的藥物緩減疤痕。Liu等[44]將疏水性藥物積雪草苷裝載到絲素納米纖維水凝膠中用于全層皮膚缺損修復,實現了無疤組織再生。該方法通過簡單的混合離心,達到了更高的藥物裝載效率,優于早期研究報道的積雪草苷負載系統。然而,從水凝膠中釋放出的積雪草苷含量較少,且持續時間較短。Ding等[45]以自組裝絲素蛋白納米纖維水凝膠負載去鐵胺(DFO),利用納米纖維與DFO之間的強物理結合力實現DFO零級釋放達40 d以上。該水凝膠通過DFO的持久釋放刺激血管生成,促進細胞遷移及組織向內生長,并減弱藥物的細胞毒性,最終促進創面更好的愈合。

感染是創面修復中的另一難題,一旦發生會大幅延緩愈合進度,甚至危及生命。因而,許多研究集中于開發抗菌抗感染的絲素蛋白敷料。Yerra等[46]通過靜電紡絲技術制備負載抗生素(環丙沙星、阿莫西林和制霉菌素)的絲素蛋白/聚乙烯醇復合納米纖維膜用于治療燒傷創面,研究發現該材料對燒傷創面膿液感染病原菌具有抗菌敏感性,可有效治療創面感染,促進細胞的增殖和創面愈合。為了同時實現抗感染和創面修復,采用抗感染藥物及納米銀進行修飾,用于增強敷料的廣譜與長久抗菌性。Zhang等[47]對絲素、甘草酸和銀進行化學交聯,制備出具有抗菌性能的絲素/銀/甘草酸復合水凝膠敷料。該水凝膠結合了絲素良好的生物活性、銀和甘草酸的抗菌活性,能夠促進傷口愈合過程中的組織再生。銀納米顆粒和甘草酸的協同作用賦予了絲素蛋白更優異的抗菌抗感染性能,將提高傷口愈合進程。

2.5 絲素蛋白聯合干細胞

干細胞具有自我更新和多向分化能力,還能分泌多種活性因子,調節免疫反應和細胞微環境,促進組織再生,在創面修復中發揮重要作用[48]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有優良的生物學特性,能滿足創面修復中的多種需要,因而具有潛在的應用前景[49]。然而,干細胞在注射過程中的剪切應力造成的干細胞損傷,及其在傷口部位的滯留性差等問題,影響了干細胞的治療效果。最近,Li等[50]將BMSCs負載到剪切變稀的絲素納米纖維水凝膠中并將其注射到傷口部位,研究發現這不僅可以保持細胞干性,促進傷口愈合相關基因的表達,且有利于血管生成,提高膠原沉積和毛囊再生,加速傷口的愈合再生。然而,BMSCs存在數量少、來源受限、采集過程痛苦等缺陷。近年來,月經血源間充質干細胞(MenSCs)作為一種新型的間充質干細胞受到人們的關注,可通過從人子宮內膜月經出血中簡單獲得,與其他類型的干細胞相比,該干細胞具有更強的增殖、歸巢和血管生成能力,能滿足臨床對種子細胞的多重需求[51]。Mirzadegan等[52]將MenSCs植入由羊膜和絲素蛋白納米纖維組成的雙層支架中,與直接注射MenSCs或單獨應用支架相比,能更有效地促進慢性創面的愈合過程。

2.6 其 他

隨著科學技術的進步,絲素蛋白敷料的開發也更加多樣化。3D生物打印技術已可實現對生物大分子和細胞的精確定位,提供功能性全層人工皮膚移植。基因工程技術也使轉基因蠶產生了含有生長因子多肽的蠶繭[53]。Wu等[54]利用轉基因技術,獲得了表達人表皮細胞生長因子(hEGF)蛋白的轉基因家蠶,該蠶吐出的絲素蛋白不僅無細胞毒性,而且顯著促進人成纖維細胞的增殖。近年來,添食育蠶法因具有操作簡單、可大規模生產、綠色環保的優點而受到關注,如喂食碳納米管與石墨烯獲得高強度蠶絲[55],喂食納米銀獲得抗菌蠶絲[56]。基于絲素蛋白的微針敷料技術也同樣受到關注,使用該技術可開發出實現傳感與藥物遞送的智能敷料。Gao等[57]研發了一種智能絲素微針敷料,該敷料具有智能藥物釋放、生化傳感和生理監測能力,可用于表皮傳感和傷口愈合。這些新技術的出現勢必為智能敷料的開發帶來新的啟示,也為開發功能活性絲素蛋白敷料提供新思路。

3 結 語

創傷修復是一個復雜的過程,依賴于細胞、生長因子及其與生物支架間的相互作用。絲素蛋白可促進細胞黏附、再上皮化和止血,降低免疫反應,加速創面修復的進程,在促進傷口愈合中發揮著重要作用。絲素蛋白作為一種生物材料已被廣泛研究與應用,并顯示出各種類型傷口治療的潛力。進一步通過絲素自身結構設計與性能優化及生長因子、藥物、干細胞等其他生物活性分子的聯合使用,對絲蛋白材料進行功能化改性,將增強絲蛋白敷料的功效,有望開發出高效修復、降低疤痕組織生成的絲素蛋白基活性創傷敷料。

近年來,隨著微制造技術的發展,出現了智能生物活性敷料的新概念,智能傷口敷料的出現引發了學者們越來越多的關注。但目前在生物智能敷料的研發上尚待進一步深入,當傷口環境中破壞性細胞因子水平升高時,生物智能敷料需要能夠在傷口部位傳遞生物活性化合物,并與傷口環境產生主動的、動態的相互作用。此外,生物智能敷料還需要通過實時分析傷口滲出物的生理信號,監控傷口及周圍環境。然而,在臨床實踐中,這些功能性敷料還面臨著許多挑戰。未來的研究可以將生物活性絲素蛋白敷料與智能敷料相結合,在實現功能化的基礎上進一步實現智能化,即與傷口環境動態的相互作用,傷口的實時可視化監測,這將有望為創傷的臨床修復治療提供一種全新的方案。

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