中性粒細胞胞外誘捕網與肝癌關系的研究進展

張金金 周燕萍 胡作為

肝癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一。根據2020 年全球癌癥統計數據顯示，原發性肝癌在全球范圍內的新增病例約90.6 萬，死亡病例約83 萬［1］。據2022 年最新統計，在中國肝癌的發病率和病死率分別占據第四位和第二位［2］。代謝相關脂肪性肝?。∕AFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是肝癌發生的重要危險因素，其發病率和流行率呈上升趨勢，很可能超過病毒因素成為全球肝細胞癌（HCC）患者發病的主要原因［3］。雖然手術治療、化學治療、局部消融、分子靶向治療等治療手段顯著提高，但由于早期癥狀隱蔽、發展快、侵襲強，肝癌患者平均生存時間仍然很短［4］。因此，迫切需要深入了解肝癌發生發展的分子機制，以提高臨床的治療效果。

中性粒細胞是先天免疫系統的關鍵參與者。中性粒細胞通過吞噬、脫顆粒、產生活性氧（ROS）和中性粒細胞胞外誘捕網（NET）等不同機制來捕獲或降解入侵的病原體［5］。然而，中性粒細胞可以增強循環腫瘤細胞的黏附性，通過分泌細胞因子和釋放NET，促進腫瘤的生長和轉移［5］。Brinkmann 等（2004 年）首次報道了IL-8、佛波酯或脂多糖刺激中性粒細胞后形成NET。NET 是由解聚的染色質和顆粒蛋白組成的網狀結構，具有捕獲和殺死病原微生物的作用［6］。NET 的形成被描述為一種獨特的程序性細胞死亡方式，這一過程被稱為中性粒細胞炎性凋亡（NETosis）［7］。據報道，NET 在腫瘤生長、轉移及癌癥相關血栓形成中發揮著重要的作用［8］。因此，本研究首先闡述了NET 的形成機制。其次，探討了NET 在肝癌生長、侵襲、轉移以及癌癥相關血栓形成中的作用。筆者將根據最新的發現總結NET 在肝癌中的研究進展，為抗腫瘤治療提供新的思路和方法。NET 作為抗腫瘤治療的潛在靶點，在未來研究中具有廣闊的前景。

一、NET 的概述

1. NET 結構和形成

Takei 等（1996 年）首次報道了NET。NET 主要是核DNA 和顆粒蛋白組成的網狀結構，該結構上裝飾有中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、髓過氧化物酶（MPO）、組織蛋白酶G（CG）、白細胞蛋白酶3、乳轉鐵蛋白（LTF）等。高分辨掃描電子顯微鏡顯示，NET 由直徑為15～17 nm 的纖維和25～50 nm 聚集復合體的球形結構組成。迄今為止，多項研究已經揭示了NET 形成的不同途徑。在粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子、脂多糖或補體因子5a（C5a）刺激后，中性粒細胞以ROS 依賴的方式釋放線粒體DNA 產生NET，NET 的產生促進了腫瘤進展的轉移前生態位［9］。在金黃色葡萄球菌和佛波酯的刺激下，中性粒細胞核小葉形態消失，核膜破裂，去濃縮的染色質與細胞質和顆粒成分混合，內膜喪失導致細胞器消失，隨后釋放NET到細胞外空間，它的形成依賴于NADPH 氧化酶（NOX）產生的ROS［10］。在NETosis 形成過程中還涉及不同的受體，如Toll 樣受體（TLR）、NOD 樣受體、補體受體和趨化因子受體等［11］。

2. NET 形成的機制

2.1 NOX 依賴性NETosis

NET 的形成過程始于病原體和多種物質的刺激，如佛波酯、抗體、膽固醇晶體、脂多糖、IL類等，這些外來刺激激活中性粒細胞表面的特異性受體，細胞表面受體的激活導致蛋白激酶C（PKC）/Raf/MEK/ERK 激酶信號通路的活化和gp91phox 磷酸化，促進細胞內鈣離子增加，從而激活NOX 的活性，隨后產生ROS［12］。ROS 的產生觸發NE 和MPO 解離。NE 從膜相關復合物解離進入胞漿，并依賴于MPO 激活其蛋白水解活性。在細胞質中，NE 可結合并降解F 肌動蛋白，然后再從嗜天青顆粒轉移至細胞核。在那里NE 可降解部分核小體組蛋白，促進DNA 濃縮。隨后，MPO 消耗過氧化氫（H2O2）生成次氯酸，協同增強染色質解聚。解聚的染色質進入胞質， GSDMD 誘導質膜破裂，驅動染色質排出細胞外空間，導致中性粒細胞死亡，釋放出NET。此外，在這個過程中，肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）也被激活，在中性粒細胞中PAD4 高表達，催化組蛋白精氨酸殘基轉化為瓜氨酸，導致染色質去濃縮，核腫脹，核膜和質膜通透性增加，核層粘連蛋白形成網狀結構，核膜和質膜破裂并釋放細胞外DNA［13-14］。這個過程也稱為NOX 依賴性NETosis。

2.2 NOX 非依賴性NETosis

中性粒細胞在金黃色葡萄球菌、革蘭陽性桿菌等刺激下，迅速釋放NET，這一過程中性粒細胞經歷了明顯的形態變化，表現為多葉細胞核變圓并濃縮，內、外核膜分離，囊泡出芽，囊泡內充滿核DNA，然后將DNA 釋放到細胞外空間。整個過程是一種獨特的、快速的，不依賴于NOX 的途徑。重要的是，在NET 釋放后，中性粒細胞質膜未破裂，且無核中性粒細胞仍然存活并保持遷移和吞噬能力。此外，在微生物、鈣離子載體A23187 和離子霉素等刺激下，中性粒細胞表面特異性受體（TLR4、TLR2 受體和補體受體3）被激活，與配體結合觸發內質網中鈣的釋放，導致細胞內鈣濃度增加，然后打開質膜鈣通道，觸發了中性粒細胞中線粒體ROS 的產生，并激活了小電導鈣激活鉀離子（SK）通道和PAD4［10］。PAD4 是一種瓜氨酸蛋白酶，它被激活后轉移至細胞核，在那里PAD4 將精氨酸轉化為瓜氨酸，瓜氨酸化的組蛋白所帶正電荷減少，降低了組蛋白與帶負電荷DNA 之間的親和力，組蛋白從DNA 中解離，導致緊密的染色質結構喪失，最后染色質解聚［15］。這被認為是形成NOX 非依賴性NETosis 所必需的。此外，中性粒細胞用粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子與脂多糖或C5a 聯合刺激時，NETosis 的形成依賴于線粒體以ROS 的方式釋放DNA。使用ROS 抑制劑二苯基氯化碘鹽時，發現在相同條件下中性粒細胞線粒體DNA 釋放完全阻斷。因此，形成這種NET 的釋放被認為是線粒體NET 或者NOX 非依賴性NETosis［16］。

二、NET 與肝癌

NASH 是發展為肝癌的重要危險因素。據報道，NASH 患者血清中NET 標志物水平明顯升高。van der Windt 等（2018 年）研究顯示，在STAM小鼠模型中，肝臟中可見大量中性粒細胞浸潤和NET 的形成，NET 的釋放導致炎性細胞因子產生和肝癌進展。然而，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）減少了STAM 小鼠中浸潤性巨噬細胞和炎癥因子的產生，抑制NASH 向肝癌進展。此外，在NASH 相關的HCC（NASH-HCC）中，NET 與幼稚的CD4+T 細胞表面TLR4 受體相互作用，啟動代謝重編程，調節性T 細胞（Tr）分化，重塑免疫抑制微環境，促進NASH-HCC 的發生和發展。然而，在體內使用PAD4-/-小鼠或DNase I 可阻斷NET 的形成，降低Tr 細胞的活性，預防NASH-HCC［17］。

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的主要原因。Yang 等［18］在肝癌患者血清和腫瘤組織中觀察到NET 標志物MPO-DNA 水平明顯高于健康對照組。MPO-DNA 是癌癥患者無復發生存期和總體生存期的獨立預測標志物［19］。最近相關研究報道，在肝癌患者中，中性粒細胞以線粒體ROS 依賴的方式形成富含線粒體DNA 的NET，這些NET 可觸發腫瘤炎癥反應，促進腫瘤細胞侵襲和轉移［20］。然而，NET 對肝癌增殖、侵襲和轉移以及癌癥相關血栓的形成中的具體機制知之甚少。Tohme 等（2016 年）報道，腫瘤細胞可以誘導中性粒細胞釋放NET 促進手術應激后肝臟轉移的發生和發展。NET 的主要成分DNA（NET-DNA）與腫瘤轉移有關。NET-DNA 可能作為一種趨化因子來吸引腫瘤細胞導致遠處轉移。跨膜蛋白CCDC25 是腫瘤細胞上的一種NET-DNA受體，可感知胞外DNA，隨后激活ILK-β-parvin-RAC1-CDC42 級聯反應，促進腫瘤細胞黏附、增殖和遷移。敲除CCDC25 基因顯著抑制了NET 對腫瘤細胞的黏附、遷移和細胞骨架重塑。使用DNase I 處理荷瘤小鼠，防止了NET 的形成和肝轉移的發生［21］。在小鼠肝臟缺血/再灌注（I/R）模型中，血小板TLR4 以ERK5/整合素GP Ⅱb/Ⅲ a 依賴的方式誘導血小板活化和血小板-腫瘤細胞聚集體的形成，促進NET 捕獲循環中的腫瘤細胞和手術應激后的遠處轉移。敲除TLR4 可以使小鼠免受肝臟I/R 模型中NET 誘導的轉移潛能［22］。在盲腸穿刺不結扎的裸鼠模型中，中性粒細胞釋放的NET 激活了TGF-β 信號通路，促進腫瘤細胞外滲，并植入肝臟和腹膜中，誘導腫瘤細胞增殖和轉移。使用TGF-β 通路抑制劑LY2157299 可明顯抑制肝臟和腹膜轉移［23］。在體外，腫瘤浸潤性中性粒細胞通過糖酵解和磷酸戊糖途徑激活NOX-ROS 信號通路觸發NET 的形成，NET 誘導HepG2 腫瘤細胞上皮-間充質轉化，促進腫瘤細胞侵襲和遷移［24］。此外，肝癌細胞來源的CXCL8/IL-8 以NADPH 依賴的方式觸發中性粒細胞釋放NET，與NET 相關的CG下調了E-鈣黏蛋白的表達，增加體外炎癥因子水平，促進腫瘤細胞的侵襲。阻斷PAD4 或抑制CG，減少了NET 的形成，削弱了肝癌細胞的侵襲和轉移能力［25］。

門靜脈血栓形成是HCC 患者預后不良的主要因素。據報道，HCC 患者，尤其是門靜脈癌栓和肝外轉移患者血清中MPO-DNA 水平明顯高于健康對照組，并與肝癌的惡性進展有關［25］。Seo 等（2019年）在HCC 合并肝硬化患者中發現，接觸系統標志物水平（Ⅻa）隨著NET 的形成而逐漸升高，并與肝病嚴重程度呈正相關，這些標志物被發現是肝癌患者門靜脈血栓的重要危險因素。NET 在肝臟I/R 后激活血小板誘導全身高凝狀態，導致遠處器官損傷和免疫血栓形成。然而，利用DNaseⅠ處理小鼠，減少了中性粒細胞浸潤，阻止了NET 的形成，減輕和緩解肝臟I/R 后全身高凝狀態和遠處器官微血栓形成［26］。

三、結 論

最初NET 被認為是一種捕獲和殺死病原微生物的防御系統。然而，近年來相關研究表明，NET在多種惡性腫瘤進展中發揮重要作用。本文主要闡述了NET 的形成機制以及其在肝癌中的作用，如上所述，某些外來刺激或細胞因子觸發NET 的形成，NET 可以通過激活下游信號通路促進腫瘤發生發展。另外，NET 可以充當血栓支架，捕獲和激活循環中的血小板，促進癌癥相關血栓形成。靶向NET 是一種有前途的抗腫瘤治療策略。深入了解NET 在肝癌發生發展中的機制，對抗腫瘤的治療具有重大意義，為治療方案的設計和新藥物開發提供新思路。然而，目前關于NET 在肝癌的生長、轉移和癌癥相關血栓形成的機制屈指可數，在未來需要更多的臨床、體內及體外實驗進一步研究NET 與肝癌及其微環境的關系。