代謝組學在食品質量安全領域的應用進展

沈央紅，方金玉，朱軍莉*，王彥波

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310018）

食品安全是關乎國計民生的重要內容，是保障現代經濟社會和諧穩定發展的基礎與前提。當前，社會經濟發展水平顯著提升，促進我國食品行業安全整體水平不斷上升，并對食品安全檢測和控制提出更高的要求。然而，由于食品污染物的來源路徑趨于多元化，既有來自食品原料、加工生產過程的污染物，又有來自食品貯存、運輸、銷售等環節的污染，使食品安全控制難度不斷提高，對影響食品安全潛在威脅因素的辨識難度同步提高，導致農獸藥殘留和摻雜摻假等食品問題頻頻發生[1]。同時，我國近10 年由食源性致病微生物引起的食品安全事件比例高達60%以上，因此，針對食源性致病微生物監測和控制研究亟待加強。

傳統的微生物檢驗方法和化學儀器檢測等食品安全分析方法存在檢測時間較長、成本較高等諸多不足。為此，現代食品安全檢測和控制研究中引入了代謝組學技術。代謝組學是在基因組學、蛋白組學和轉錄組學基礎上新發展起的系統生物學技術，以高通量、高靈敏度、高分辨率的現代儀器分析方法為手段，對細胞、體液和組織中所有代謝物進行無偏向的定性與定量分析[2-3]。代謝組學的整體性路徑通常包括樣品制備、代謝物提取、代謝物分離、數據檢測和數據處理，其中檢測以核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術和色譜-質譜聯用技術最為常見，數據分析一般包括基線校正、濾噪、峰對齊、標準化和歸一化等步驟[4]。相較于其他組學，代謝組學中代謝物的種類和數量變化更易于檢測，所運用到的儀器技術手段也更為簡單，可實時監測生物體生理環境變化[5-6]。近年來，代謝組技術在食品安全領域的研究與應用不斷拓展，涉及食源性致病微生物檢測、殘留物和產品品質鑒別等多個方面，促進了食品從農場到餐桌“全鏈條”的質量監控水平，成為當前的研究熱點[7-8]。因此，本文歸納近年來食品安全中代謝組學研究方法和應用狀況，并重點闡述代謝組學在食源性致病微生物、獸藥殘留、轉基因食品、生鮮食品品質和肉制品摻假鑒定中的應用，旨在為進一步推動代謝組學及多組學技術聯用在食品安全檢測和控制中的應用提供理論支持。

1 靶向和非靶向代謝組學

根據研究目的，代謝組學可分為靶向和非靶向代謝組學。非靶向代謝組學針對生物體所有內源性代謝物，獲取大量的代謝組分物質信息，進而鑒別不同個體間的差異以發現差異代謝物[9]。Dai Weidong等[10]利用非靶向代謝組學發現氨基酸、兒茶素、二聚兒茶素和芳香前體是白茶、紅茶和綠茶間最顯著的差異代謝物。比較玉米飲料發酵前后的差異代謝物，結果顯示這些差異代謝物參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，酪氨酸代謝，雙組分系統，嘌呤代謝以及檸檬酸循環5 條代謝通路[11]。非靶向代謝組學能獲得大量復雜的數據，但在原始數據采集以及處理方面存在問題，分析平臺對代謝物的識別精度仍有待提高。靶向代謝組學主要針對某一類代謝物進行分析，相較于非靶向代謝組學更具有針對性，代謝物確證更簡單，重復性較高，要求研究者有較強的專業知識[9]。雷嗣超等[12]通過主成分分析（principal components analysis，PCA）和差異代謝組分聚類分析發現消化環境中消化酶的存在和pH值變化會降低板栗皮中兒茶素類物質的含量，差異代謝物中沒食子兒茶素含量變化最為顯著。

如圖1所示，通常情況下代謝組學技術主要包括以下流程[13]：首先是樣品采集，樣品量要充足且有代表性，一般為5～10 個重復樣；第二，樣品預處理和制備，通常采用粉碎、冷凍干燥和稀釋等方法，但分離檢測技術的不同，樣品所采用的預處理技術也有差異，如運用NMR檢測的液體樣品可用含氘代水的磷酸緩沖液提取[14]，而色譜-質譜聯用技術中通常采用液-液萃取或頂空固相萃取技術；第三，樣品分析和數據采集，主要通過高精密度和高準確性儀器進行分析，以NMR技術和色譜-質譜聯用技術為主，近年來毛細管電泳-質譜技術以其獨有特性被廣泛應用于生命科學領域[15]；第四，數據分析和可視化處理，由于數據復雜繁重，需要借助專業的代謝分析軟件和數據庫。

圖1 代謝組學技術主要流程[13,16]Fig.1 Flor chart of metabolomics technology[13,16]

2 代謝組學技術平臺

2.1 核磁共振技術

目前代謝組學中最常見的檢測方法是NMR，它不需要對樣品進行復雜的前處理，對樣品破壞性小。固體或半固體樣品經破碎后采用緩沖液提取，即可采用NMR技術檢測，使樣品在最接近生理狀態下進行實時測定[17]。NMR對產品中的1H、13C、15N、23Na、39K和31P等核素進行分析，以獲得各種NMR指紋圖譜，對氨基酸、有機酸等有機化合物單體進行分析識別，在分子水平闡述食品的特質，可對食物的化合物作系統分析，也可針對性地分析特定化合物[18]。研究發現，基于NMR識別懷山藥潛在特征代謝物，發現未加果皮的懷山藥中亮氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸含量較高，含果皮懷山藥中α-葡萄糖、蝙蝠葛素IV、蝙蝠葛素I、天冬酰胺和β-葡萄糖等含量較高[19]。Shumilina等[20]對歸一化后的新鮮和解凍大西洋鮭1H NMR波譜進行統計分析，PCA及方差分析顯示解凍后魚肉貯藏第2天時才會形成天冬氨酸，天冬氨酸含量受解凍后貯藏時間的影響，推測天冬氨酸含量可視為鮭魚冷凍或解凍的標志。另外，1H NMR在食品質量鑒別和產地溯源等領域可發揮重要作用，采用該技術分析多種不同地區市售肉桂皮的化學物質時發現，香豆素是鑒定越南肉桂的關鍵成分，其含量更高[21]。然而，相較于質譜技術，NMR技術在檢測濃度差異較大的物質時靈敏度較低，物質動態檢測范圍也較小。

2.2 色譜-質譜聯用技術

色譜-質譜聯用技術作為食品領域代謝組學主流檢測技術之一，同時兼有色譜和質譜的特點，主要包括氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）和LC-MS。色譜-質譜聯用技術具有高靈敏度和高選擇性的特點，檢測后可得到質譜保留時間、質荷比和離子強度，但分析速度慢。而GC-MS需要對樣本進行衍生化處理，操作不當會影響檢測靈敏度[22]。Heena等[23]采用GC-MS對牛、羊酸乳進行非靶向代謝物譜和通路富集分析，鑒定得到95 種代謝物，發現牛、羊酸乳冷藏第14天時二肽和三肽含量均有所上升，主要代謝物的差異變化與氨基酸代謝途徑有關。通常質譜結合高通量分離技術可獲得大量數據，LC-MS通過分離作用使目標物質引入質譜檢測系統，將分析得到的大量復雜數據簡單化，簡化后的譜圖可以觀察到樣品間的差異。LC-MS適用于高沸點、不易揮發、不易衍生化的化合物，分離度高，且能同時測定多種代謝物[24]。結合MALDI-TOF-MS指紋圖譜和高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）檢測到河豚湯風味及營養與19 種化合物有關，鑒定出(Z)-3-苯基-2-丙烯和2-苯基-4-戊二烯兩種香味標記物[25]。

2.3 數據分析方法

作為代謝組學的重點，運用統計分析方法可將直接的數據轉化為表示生物體代謝物信息的數據。常用的識別模式主要分為有監督和無監督兩種學習方法。無監督學習方法中應用最廣泛的是PCA和CA。有監督學習方法包括PLS-DA和OPLS-DA[26]。

PCA通過將可能相關變量轉化為線性不相關變量的降維方法獲得得分圖和載荷圖，體現樣本與變量之間的聯系，樣品點分布越近，說明樣品間差異性越小。通過降維PCA把多個組分轉化為幾個綜合指標，根據各指標之間的相關性和差異性，挑選出影響食品性質的主要特征成分。CA根據質量性質的相似程度對樣本進行聚合，形成表征樣本間相似程度的樹狀圖[27]。PLS-DA和OPLS-DA是在明確樣品分類條件下對不同類別樣品進行分離，分離效果比PCA好。相較于PCA只有一個數據集，PLS-DA增加數據集能更好地分析樣品代謝物間差異性，并改善觀察組之間的分離，但可能會導致模型過度擬合。OPLS-DA是在PLS-DA的基礎上進行正交變換矯正，濾除與分類信息無關噪音，增強模型的信息能力[28]。當分類識別獲得后可使用變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）值進行分析，通過VIP值選擇差異代謝物并與數據庫進行比較，找出潛在生物標記物。Liao Renyong等[29]評價變質干腌火腿，PCA和CA結果表明寡肽和氨基酸衍生物是區分正常火腿和變質火腿的關鍵代謝物，結合PLS-DA模型和代謝通路分析得到，嘌呤代謝、嘧啶代謝和蛋白質降解是影響干腌火腿變質的主要代謝途徑。

代謝組學的數據分析需要借助各種代謝途徑和生物化學數據庫，常用的數據庫包括KEGG、HMDB和MMP[27]。相對于基因組學和蛋白組學已有完善的數據庫，代謝組學的數據庫仍有待完備和發展。

3 代謝組學在食品質量安全領域的應用

代謝組學技術在食源性致病菌、獸藥殘留、轉基因食品、生鮮食品品質和肉制品摻假等食品安全領域應用廣泛（圖2）。

圖2 代謝組學在食品質量安全領域的應用Fig.2 Application of metabolomics in food safety and quality

3.1 食源性致病菌檢測

食源性致病微生物引起的食品中毒事件仍屢見不鮮，常見的食源性致病菌有致瀉性大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等，某些致病菌能產生肉毒毒素、腸毒素等致命毒素[30]。代謝組學技術能較準確獲得食源性致病微生物代謝產物數據和指紋圖譜，更加靈敏地檢測和識別致病菌，可用于開發快速鑒定的特定生物標志物（表1）。基于UPLC-QTOF-MS的代謝組學技術能檢測攜帶耐藥基因ermB的空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni），鑒定出糖、生物堿、脂肪酰胺、肽和苯甲酸等36 種代謝物[31]。基于UPLC-MS的代謝組學方法可診斷腹瀉患者中艱難梭菌（Clostridium difficile）的感染情況，所鑒定代謝物為脂肪酰胺、肉堿、氨基酸、鞘氨醇、初級膽汁酸、次級膽汁酸、酯、溶血磷脂酰膽堿和鞘磷脂[32]。UPLC具有高靈敏度和高效率的特點，能有效縮短分析時間，而與QTOF-MS聯用能夠快速和全面地篩選代謝物。

表1 代謝組學技術檢測病原菌中代謝物的應用Table 1 Application of metabonomics technology for detecting metabolites of pathogenic bacteria

病原菌的污染種屬和數量與氨基酸、胺和多胺、脂肪酸、糖、糖醇及有機酸等代謝物有關[33-36]。利用直接注射電噴霧飛行時間質譜（direct injection electron spray time-of-flight mass spectrometry，DI-ESI-TOF-MS）檢測空腸彎曲桿菌的代謝，代謝物指紋圖譜顯示彎曲桿菌突變株中關鍵氨基酸的降解酶基因存在缺失，很容易從同基因型的親代菌體中被區分出[36]。采用MALDI-TOF-MS指紋圖譜檢測意大利乳制品中的金黃色葡萄球菌[37]，該技術可快速、準確和經濟地檢測細菌代謝物。NMR技術不破壞樣品，且樣品制備簡便，使NMR相較其他技術應用更具優勢。利用NMR檢測發現賴氨酸、精氨酸、α-酮戊二酸、腺苷、富馬酸等代謝物是區分非致病性大腸桿菌ATCC 25922與致病菌株O26:H11的主要物質，其中致病性大腸埃希菌在能量代謝和氨基酸代謝（如賴氨酸和谷氨酸）更顯著，且表現出更高的耐酸性[38]。

與UPLC-MS相比，GC-MS代謝組學在區分選定細菌的代謝物圖譜方面更有效[33]。GC-MS可區分5 株不同血清型的沙門氏菌，各血清型產生代謝物質主要是氨基酸、有機酸和胺類[39]。GC-MS可檢測到大腸桿菌和沙門氏菌的代謝產物有葡萄糖、生物堿、L-組氨酸、甘氨酸和L-酪氨酸，以及1-辛醇、1-丙醇、1-丁醇、2-乙基-1-己醇和2,5-二甲基吡嗪等揮發物[44]。由于能快速檢測代謝物，GC-MS能檢測微生物在動植食品基質中的代謝變化，在追溯、追蹤食源性微生物及其毒素的污染方面具有優勢。

3.2 獸藥殘留檢測

動物源性食品中瘦肉精和類固醇等獸藥屢禁不止，一旦殘留劑量超標就對人體造成危害。瘦肉精又叫鹽酸克倫特羅，屬于β-受體激動劑，經過食物鏈的累積最終會導致人體食物中毒。基于液相色譜-高分辨率質譜（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）分析牛肝臟整體代謝水平，篩選出兩個間接標志物煙酸和5’-脫氧-5’-甲硫腺苷，通過這兩個標志物及其代謝途徑中煙酰胺和甲硫氨酸代謝豐度比率構建模型，可鑒定牛肉是否含克倫特羅[45]。為優化克倫特羅檢測技術，以0.1 mol/L高氯酸溶液作為提取溶劑，正己烷脫脂，選擇Eclipse C18色譜柱，乙腈與體積分數0.1%甲酸溶液作為流動相，優化固相萃取條件，檢出限達到0.02 μg/L[46]。基于UPLC-QTOF-MS發現2-吲哚羧酸和醋酸氟甲酮可作為監測瘦肉精、萊克多巴胺、沙丁胺醇3 種β-受體激動劑的生物標志物[47]。目前大多數研究都是以瘦肉精作為β-受體激動劑的模型，萊克多巴胺等仍有待于研究。

由于LC-MS的靶向代謝組學覆蓋有限，對未知化合物仍無法檢測，近年來不少學者探索非靶向篩選方法分析已知或未知的化合物。通過NMR非靶向代謝組學區分沙丁胺醇對公牛給藥前后代謝特征變化，馬尿酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸、甲酸鹽、正苯乙酰基、苯甲酸鹽和苯乙酸鹽可作為牛中沙丁胺醇檢測的潛在生物標志物[48]。Liang Wenying等[49]建立了一個包含3 710 種獸藥及其代謝產物的內部質譜數據庫，歸納質譜中母體藥物及其代謝物的裂解特征，并將該方法應用于雞蛋樣品中4 種獸藥及3 種代謝物的篩選。非靶向篩選方法可根據碎片化特征找到動物源性食品中存在的不同形式已知或未知的獸藥殘留，在原有非靶向代謝組學基礎上，引入神經網絡模型與XGBoost進行嵌套交叉驗證對比，開發出生物信息學工具SteroidXtract，提供了一種新的生物學驅動識別類固醇的方法[50]。

3.3 轉基因食品甄別

轉基因技術在世界許多國家已經成為提高作物產量、品質的有力工具，我國規定必須對轉基因食品進行標識[51]。食品中轉基因成分主要是使用聚合酶鏈式反應技術檢測，不少學者發現代謝組學技術也可以有效區分轉基因食品與傳統食品[52]。Zhang Liyuan等[53]采用非靶向代謝組學分析非轉基因和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）轉基因玉米的代謝途徑，發現Bt轉基因玉米有氨基酸、糖、脂肪酸、植物甾醇等28 種特定的代謝物，代謝物和特異性代謝物種類均多于非轉基因玉米，且Bt轉基因玉米中富集到更多的代謝途徑。柑橘潰瘍是由Xac細菌引起的疾病，通過評估Xac細菌感染后不同階段的柑橘代謝特征，發現非轉基因柑橘在感染Xac細菌早期次級代謝產物（如色氨酸、酪氨酸和腐胺）會發生改變，而轉基因柑橘由于肉毒桿菌毒素保護在感染后期才發生代謝變化，其氧化應激反應更加溫和[54]。

轉基因作物在基因轉化中產生超過當前認知水平的不可預料改變被稱為非預期效應，非預期效應是否發生和發生條件一直是公眾關心的問題[55]。Liu Weixiao等[56]對2A-7、CC-2和2A-7×CC-2疊合轉基因玉米及其相應的非轉基因玉米進行代謝通路富集分析，發現大多數玉米差異表達蛋白和差異代謝物參與次級代謝產物的生物合成，轉基因和基因疊加不會對玉米品種中蛋白質和代謝物分布造成明顯的非預期效應。現在大量轉基因作物涌入市場，代謝組學能提供作物基因轉化后相關代謝物的信息，有利于提高新轉基因作物在食品安全評估的科學性。

3.4 生鮮食品品質鑒別

代謝組學技術在生鮮肉制品和水產品的品質及貯運劣變評估中的應用逐漸受到重視，有助于深層次揭示產品在貯運期間因酶和微生物分解、蛋白質氧化、脂質水解等代謝變化而導致的品質劣變和腐敗。代謝組學技術可監測肉類在不同貯存和加工條件下代謝物的動態變化，預測產品的新鮮度。Mansur等[57]采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-GC-MS分析冷藏牛肉中的揮發性化合物變化，發現乙酸、乙醇、2-甲基丁-1-醇、2,3-丁二醇、2-丁酮、雙乙酰、2-庚酮和乙偶姻的含量與牛肉品質顯著相關。代謝組學結合生物信息學分析能夠監測冷藏牛肉質量變化，發現谷氨酸、絲氨酸和精氨酸可作為牛肉感官風味變化的指示物[58]，還能夠揭示在冷藏牛肉中接種兩種致腐菌形成差異的代謝產物，且組氨酸代謝是關鍵代謝通路[59]。Wen Dongling等[60]使用LC-MS技術分析冷藏雞肉的代謝物，結果顯示雞肉貯藏過程中包括氨基酸、胺、核苷酸、碳水化合物、有機酸等多種代謝物顯著變化。

大西洋鮭魚和金槍魚是消費量較大的水產品，Jaaskelainen等[61]通過1H NMR譜分析發現，在3 ℃真空冷藏12 d后的大西洋鮭魚比金槍魚片品質下降更快，與其前體物質氧化三甲胺和葡萄糖有關。Sun Shengming等[62]比較日本沼蝦缺氧6、24 h及缺氧24 h后復氧6 h的代謝變化，發現缺氧比正常氧條件下沼蝦糖酵解相關酶活性更高，復氧導致氨基酸如纈氨酸、亮氨酸含量顯著減少。活蝦夷扇貝濕藏36 h后，篩選到二十二烷酸、酪胺、脯氨酰谷氨酸、二磷酸腺苷葡萄糖、尿苷5’-二磷酸、3-磷酸絲氨酸和檸檬酸7 種顯著差異代謝物，三羧酸循環是最易受到影響的代謝途徑[63]。

3.5 肉制品摻假鑒別

肉類是全世界消費量最大的食物之一，其需求量急劇增長給肉類行業帶來了新的挑戰。肉類的真實屬性包括動物物種和品種、產地、品質、摻假等，肉品原產地和品種是影響肉類品質和價格的重要因素。利用溯源技術可以檢測市面上產品的原產地，從而獲得從生產到銷售一系列溯源體系的信息。然而，溯源檢測受肉類品種、氣候、濕度等多因素共同影響，評價指標波動較大。代謝組學技術融合多種技術，有效提高了產品溯源的正確判別率。Ueda等使用GC-MS法發現通過肌肉組織中的代謝物數量可以區分日本黑牛和荷斯坦牛，其中癸酸、尿酸是評估日本黑牛大理石花紋等級的潛在生物標志物[64]。

由于肉類價格差異較大，用低質量肉品替代優質肉品，或者是低價肉摻雜低價肉的現象越來越多，損害了消費者權益。根據不同肉品中代謝物之間的差異性，可以實現牛肉、豬肉、羊肉以及雞肉間的有效鑒定（表2）。HS-SPME/GC-MS可以鑒別摻假牛肉，Pavlidis等[65]提出一種基于揮發性指紋圖譜的肉糜鑒別方法，發現醛（乙醛、庚醛等）、醇（丁醇、1-戊烯-3-醇等）、酮（3-羥基-2-丁酮、2-丁酮等）和酯（乙酸乙酯）等化合物是用來區別牛肉和合成牛肉的揮發性生物標志物。采用氣相色譜離子遷移譜檢測發現，羊肉中摻入大于5%（以體系質量計，下同）的豬肉后，主要風味物質如芝麻酚、2-乙基-1-己醇、2-戊酮含量會減少，正己醇、2,3-丁二酮、羥基丙酮等含量增加；羊肉中摻入大于10%的雞肉時，3-甲硫基丙醛、正己醇、反-2-辛烯醛、3-辛酮等物質含量減少，而丙醛含量增加[66]。基于1H NMR可區分白肉（雞肉）和紅肉（牛肉、驢肉和山羊肉）[67]，肌酸、亮氨酸和膽堿等含量變化可區別白肉和紅肉，而肌苷、肌酸和醋酸鹽等含量變化可區分牛肉、驢肉和山羊肉。Consolo等[68]比較安格斯×尼羅爾雜交牛黑切肉和普通肉類，顯示黑切肉經過14 d成熟后pH值和嫩度均提高，pH值與肉堿含量呈正相關，與葡萄糖-6-磷酸鹽含量呈負相關，而普通肉類pH值與精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸含量呈正相關。相較于生物傳感器和蛋白質組學等技術，代謝組學技術可以針對非特定目標物進行實時監測，然而仍存在特異性較差、時間成本高、操作復雜等問題。

表2 代謝組學在肉制品摻假中的應用Table 2 Application of metabolomics in the detection of the adulteration of meat products

4 結 語

隨著組學技術的不斷發展，代謝組學在食源性致病微生物檢測、獸藥殘留檢測、轉基因食品甄別、生鮮食品品質和肉制品摻假鑒別等食品質量安全多領域研究中取得了積極進展，并顯示了良好的應用前景。該技術不僅提升食品品質和安全，而且有助于揭示食源性致病菌作用機制、轉基因食品的安全性及肉類品質的控制技術研發。然而，現階段代謝組學面臨樣品分析結果不穩定、檢測儀器范圍有限、數據庫不完善等諸多挑戰，如何優化樣品前處理、選擇高通量的檢測技術、建立更標準和完善的數據庫，都需要進一步研究。因此，代謝組學在食品致病微生物鑒定、摻假鑒別和品質監控等方面仍未發揮出最大潛力。目前，多組學技術聯合是一大趨勢，將代謝組學結合基因組學、蛋白組學和轉錄組學，構建出完整的生物信息庫，提高數據質量和擴大代謝物范圍，從表型-通路等多角度解析危害因子和營養物質劣變的作用機制，為食品質量安全評價和控制提供科學的技術手段。