釀造用米曲霉菌種選育的研究進展

范夢雪，王璐瑤，陳衛衛，王新杰，王友升，程仕偉,*

（1.魯東大學生命科學學院，煙臺市生物發酵與分離工程實驗室，山東 煙臺 264025；2.山東食圣釀造食品有限公司，山東 煙臺 261411；3.北京工商大學輕工科學技術學院，北京 100048）

米曲霉作為絲狀真菌中的一個常見種，屬曲霉屬，分布范圍廣泛，主要分布于發酵食品、糧食、土壤和富含豐富有機物的腐敗物中。不同于黃曲霉，米曲霉不會分泌致癌的黃曲霉毒素，是世界衛生組織和美國官方認證的食品級公認安全（generally recognized as safe，GRAS）菌株[1]；其具有生長條件寬松、繁殖能力旺盛、抗逆性強、產孢量大、酶系豐富等特點，廣泛應用于食品行業。米曲霉在食品發酵應用中具有一千多年的歷史[2]，是我國食品釀造的重要菌種。米曲霉分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、脂肪酶等，與其他微生物分泌的酶系共同作用[3]，可將原料底物分解，經過復雜的生化反應，最終使發酵終產物具有特殊的顏色、香味、口感和狀態[4-5]。此外，米曲霉的代謝產物也被廣泛應用于醫藥、化妝品、農業等領域[6-7]。

米曲霉無法進行有性雜交育種[8]，且形成多核分生孢子，使得經典的遺傳操作難以實施[9]。米曲霉保藏過程中容易發生菌種的退化，導致酶活性及代謝機能衰退，最終影響終端產品的質量和生產效率。為了進一步提高其酶類及其他代謝物的產率，確保發酵過程中產品質量的穩定，滿足不同的生產需求，國內外開展了對米曲霉菌株的改造。米曲霉分泌機理的深入研究和分子生物學技術的發展促進了米曲霉在現代生物領域中的應用。國內外育種工作者通過不同的方法定向改良菌株以擴大菌種資源，取得了顯著的成效。本文主要歸納分析國內外提高米曲霉產酶量或代謝物活力的自然選育、誘變育種和基因工程等育種方法的研究進展，以期為研究同行拓展思路，并為米曲霉菌種的生產應用提供參考依據。

1 自然選育

早期釀造行業所用的菌株均來源于野生環境中，通過自然接種的方式進行制曲。自然選育無法保證米曲霉菌株產蛋白酶活力維持在較高的水平，同時也容易被其他雜菌污染，導致產品質量降低。因此，微生物純培養即自然選育逐漸取代自然培養，通過劃線培養、稀釋涂布、透明圈法等，分離野生環境中分泌蛋白酶能力較強、抗雜菌、環境耐受力強的米曲霉。通過進一步改進培養條件，既能夠盡可能地減少發酵過程中其他雜菌的摻入，提高曲的質量，同時也可以有效地縮短制曲的時間，保證發酵產物的風味和品質，自然選育作為一種經典的育種方式被沿用至今。

林祖申[10]從福建永春醬油曲中篩選出了產酶性能優良的米曲霉中科AS3.863，其蛋白酶活力達到95.1 U/g。El-Korany等[11]在采集的土壤樣本中分離出了胰脂肪酶有效抑制劑產生菌——米曲霉AspsarO，該菌株代謝產物的胰脂肪酶抑制率與奧利司他的胰脂肪酶抑制率（（41.00± 2.45）%） 沒有顯著差異，經生產條件的順序優化，米曲霉AspsarO胰脂肪酶的抑制率最高可以達到61.4%，且對高脂飲食（high-fat diet，HFD）實驗鼠的食欲有明顯的抑制效果，減緩了其體質量增加速率。Ao Xiaolin等[12]在發酵的蠶豆中分離出了一株中性蛋白酶高產菌株Y1，中性蛋白酶經純化后比活力（2 264.3 U/mg）提高了10 倍，該中性蛋白酶具有良好的耐高溫性和廣泛的酸堿性，在工業上具有良好應用前景。Mamo等[13]從埃塞俄比亞土壤樣品中分離篩選出可分泌凝乳蛋白酶的米曲酶DRDFS13，經過優化后的培養基培養后，凝乳活力從優化前的77.74 U/mL提高到168.47 U/mL。

雖然自然選育優良菌株的方法非常經典，但隨著科技的進步，這種育種方式凸顯出一些弊端，如菌株在自然環境下發生自發突變的幾率較低；突變方向具有不確定性和多害少利性，難以控制菌株的性狀；育種周期較長，工作量大。因此，需要結合人工誘變的技術來改變菌種的遺傳信息，從而改變其結構或功能以達到菌種改造的目的。

隨著科技的發展，通過篩選自發產生正向突變的菌株已經無法滿足工業上的需求。操作更方便、更高效的菌種選育方法，如物理誘變、化學誘變、原生質體融合和復合誘變等多種誘變育種技術逐步被用于微生物菌株的性能改造。

2 物理誘變

2.1 紫外誘變

紫外誘變技術具有操作簡單、誘變快速、效率高、無二次污染、誘變隨機性較強等特點[14]，被廣泛用于育種工作中。生物內部的遺傳物質具有很強的紫外吸收能力，且在紫外波長為260 nm處失活率達到最大[15]。經過紫外線輻照后，會破壞DNA分子正常的配對方式而形成阻礙堿基配對的嘧啶二聚體，增加了微生物發生突變或死亡的幾率。另外，形成的嘧啶二聚體會使RNA引物的合成和DNA合成受阻，進而影響其正常的轉錄和復制[16]。

1976年，上海市糧油工業公司通過紫外誘變米曲霉AS3.863并配合高蛋白馴養技術，獲得比原菌種蛋白酶活力提高了33%的米曲霉滬釀3.042，該菌株具有產孢量大、繁殖快、抗逆性強、易培養、酶活旺盛等特點[17]。其蛋白酶活力達到142.6 U/g，不僅縮短了制曲時間，同時提高了醬油出品率。隨后，米曲霉滬釀3.042菌株在全國得到了推廣和應用。此后，許多育種工作者以米曲霉滬釀3.042作為出發菌株進行改造，以期獲得特定性狀的新菌株。Murthy等[18]對米曲霉RIB40進行紫外誘變，獲得突變株F6，其分泌的酸性蛋白酶活力是出發菌株的5.6 倍。李鵬等[19]對菌株CICC2066進行多次紫外誘變，篩選所得的菌株UY-20發酵后氨肽酶活力是出發菌株的1.54 倍，且中性蛋白酶活力由初始的830.8 U/g提高到890.2 U/g。

紫外誘變雖然具有方便、快捷、低成本等諸多優點，但頻繁使用容易導致菌株對紫外誘變產生一定的耐受性，若繼續僅通過紫外誘變則難以實現菌株成功選育。另外，從宏觀上看，現有的輻射誘變技術手段下，很難獲得新的突破性變異性狀[8]，這就要求增加誘變育種方式的多樣性，提高通過誘變獲得優良性狀菌株的幾率。

2.2 等離子體誘變

常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）是一種新興的誘變技術，在正常大氣壓下產生高活性粒子的等離子射流，改變微生物細胞膜和細胞壁的結構和通透性，并能夠引起DNA損傷[21]。研究表明，通過射頻電源并使用氦氣產生的ARTP，可使質粒DNA和寡核苷酸發生不同程度的斷裂。在對活菌細胞誘變中，ARTP誘變比紫外誘變和化學誘變呈現出更高的突變率[22]，這使得ARTP突變育種在優化微生物性狀方面具有極大潛力。ARTP使用低電壓射頻電源，具有操作簡單和安全性高等特點，越來越受到微生物育種研究人員的青睞。

童星等[23]對米曲霉As3.951進行ARTP誘變，突變株ZA189的中性蛋白酶活力由2 568 U/g提高到3 210 U/g，此外，淀粉酶和谷氨酰胺酶活力均有不同程度的提高。Shu Liang等[24]利用ARTP誘變系統對米曲霉滬釀3.042菌株進行誘變，獲得可穩定遺傳的突變菌株B-2，與出發菌株相比，其酸性蛋白酶（117.9 U/g）和中性蛋白酶（407.5 U/g）活力分別提高了54.7%和17.3%。Gao Xianli等[25]采用ARTP技術對米曲霉滬釀3.042誘變，突變株H8的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和天冬氨酸氨基肽酶活力相較于原始菌株均顯著增加，耐鹽堿性蛋白基因和天冬氨酸氨基肽酶基因表達量分別提高了約30%和27%。樊嘉訓等[26]對米曲霉滬釀3.042進行了4 輪ARTP誘變，菌株H34的蛋白酶活力提高145.6%。最近研究表明，采用氮氣微介質阻擋放電等離子體處理米曲霉KACC47488菌株的孢子可以促進孢子的萌發并激活mpkA（一種絲裂原活化蛋白激酶）激酶，增強了相關基因的轉錄[27]，通過這種方式可以縮短制曲時間，進而提高發酵速率。

ARTP具有高突變、操作安全、無污染等優點，但該技術需要專門的儀器設備，這限制了它的大規模使用。同時，此項技術無法控制突變的方向和性質，因而ARTP誘變育種技術仍有進一步完善的空間。在今后的研究中，應實現量化ARTP劑量[28]，進一步提高其誘發突變的可控性，更好地優化和推廣該技術的應用。

2.3 離子注入誘變

離子注入誘變是將離子進行高能加速處理后注入微生物胞內的誘變方法，注入的離子能與微生物發生物理、化學作用，直接或間接地使微生物胞內的遺傳物質發生突變[29]，進而可篩選獲得目標菌株。Zhao Guozhong等[30]利用氮離子注入誘變米曲霉3.042獲得突變株A100-8，其酸性蛋白酶活力達到2 834.6 U/g，提高了44.1%。凌帥等[31]對紫外誘變后獲得的菌株UV7再進行氮離子注入誘變，篩選得到米曲霉N11，其曲酸產量提高了30.38%。杜冰冰[32]采用氮離子注入誘變處理米曲霉滬釀3.042，獲得發酵性能良好的菌株A100-4，其纖維素酶和蛋白酶活力分別較初始菌提高了40%和30%。

雖然離子注入誘變具有較高的誘變幾率，但離子注入設備復雜且價格昂貴[33]，同時所需要的真空環境會導致微生物大量失水，此外，誘變過程的高溫使細胞大量死亡[34]，這些均限制了此項技術的應用。

2.4 γ射線誘變

γ射線是一種比X射線頻率更高的電磁波，更具穿透力[35]，破壞性小于快中子[36]，產生的高能電離作用力可間接產生自由基，引發基因突變和染色體畸變，改變遺傳性狀，尤其適合誘變產孢子的真菌[37]。解西玉等[38]對米曲霉采用60Co-γ射線進行誘變，當射線劑量達到800 Gy時效果最佳，獲得的突變株C8-128的曲酸產量是出發菌株的3.9 倍。研究人員將米曲霉HAk2暴露于不同劑量的γ輻射進行誘變，其中米曲霉HAk2-M26是最穩定的突變體，其曲酸產量比野生型菌株HAk2高2.03 倍[39]。Aleem等[40]通過高電離誘變劑γ射線來誘導改造菌株RIB40，得到了超級突變體M-100（6），該突變體不僅對Triton X-100和分解代謝物阻遏具有抗性，α-淀粉酶產量提高了約12 倍，而且該酶在55 ℃下不可逆熱穩定性提高了2.5 倍，在食品和飼料工業中有巨大的應用潛力。

γ射線誘變雖簡便快捷，但存在一定局限，有一定危險性；此外，輻射過程受誘變時間、誘變劑量、生物種類和環境條件等多因素影響[41]，難以控制誘變的方向和性質，導致誘變率低、致死率高、有益突變少，甚至會出現無效輻射或存活率極低的情況。因此，需要完善對相關機理和技術的研究，提高正向突變率。

2.5 微波誘變

微波是一種有高頻性和波動性的低能電磁波，對生物具有熱效應和非熱效應。微波產生的振動能夠穿透至胞內，進一步對疏水鍵、氫鍵及范德華力產生影響，并使基因結構改變，發生遺傳變異。管海華等[42]對米曲霉ZQV16進行60 s的微波誘變，篩選后得突變株ZQH48，其纖維素酶活力是出發菌株的1.5 倍。高紫君等[43]對菌株UV15進行微波誘變，篩選后得到的突變株M22曲酸產量達到34.28 g/L，比出發菌株提高了19.2%。

微波誘變因設備簡單、操作方便、易變異、安全性高等特點[44]而廣泛用于農業、工業的育種工作，但該誘變方法的非熱效應作用機制尚不明確，且誘變具有不定向性，篩選誘變株工作量大。此外，實驗室誘變多采用普通微波爐，功率無法實現連續可調，無法按需調節頻率和功率，且不能直接消除產生的熱效應，大功率的輻照會使誘變體系迅速升溫，蛋白變性失活，菌種因較強的熱效應而死亡，無法篩選出微波誘變導致的基因突變[45]，因此，需要嚴格把控輻照的時間和溫度。

2.6 激光誘變

激光誘變作為輻射微束技術中的一種新型誘變劑，集電、光、熱、磁場和電壓的綜合效應于一體，作用于微生物的DNA分子時，可造成核酸鏈的斷裂和損傷，改變遺傳物質結構，從而通過誘變作用快速改良微生物[46]。葛菁萍等[47]對米曲霉HDF-C14進行He-Ne激光誘變，通過透明圈初篩選育出了突變株HDF-C14-H8，蛋白酶產生的透明圈直徑增加了16.67%，為下一步的亞硝基胍誘變提供了出發菌株?？傮w來說，激光誘變所得的變異類型較為豐富，且遺傳穩定性較高，但成本也較高。

2.7 超高壓誘變

超高壓是指大于100 MPa的氣壓，隨著技術的進步，超高壓被廣泛用于食品行業的除菌工作[48]。研究證明，高壓可改變細胞體積，影響蛋白表達，改變DNA結構[49]，因此，（超）高壓誘變成為一種新型的微生物誘變育種方法。王華等[50]通過高壓誘變處理米曲霉3.042，發現其蛋白酶活力在壓力為0～200 MPa范圍內持續下降，但是隨著壓力進一步升高，在200～400 MPa范圍內蛋白酶活力又逐漸增大，壓力為400 MPa時酶活力達到最大值（2 142 U/g），理想的誘變株HP300a發酵后產生的成曲蛋白酶活力是原始菌株米曲霉3.042的1.43 倍。高壓、超高壓誘變開拓了微生物育種思路，可減輕因長期單一或反復誘變帶來的菌株退化問題，但具體的誘變機理尚不明晰。

3 化學誘變

化學誘變育種是采用化學試劑處理微生物，誘導遺傳變異，改變菌體性狀，根據誘變目標篩選突變菌株。不同的化學誘變劑的作用機理不同，根據其作用方式主要分為3 類：1）DNA類似物，如8-氮鳥嘌呤、5-嗅尿嘧啶等堿基類似物，其一旦參與遺傳物質的合成，就會代替正常的核苷酸配對，引起DNA結構變異、轉錄紊亂，進而引發菌株性狀的改變；2）烷化劑和亞硝基類物質，如硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）、甲基磺酸乙酯（ethyl methylsulfone，EMS）等，使DNA的堿基發生錯配和改變；3）其他類物質，如小分子嵌入型的誘變劑溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、吖啶類及其衍生物，此類物質能夠鑲嵌入DNA的相鄰堿基之間，造成移碼突變[51]。

已有報道的米曲霉的化學誘變處理，多使用第二類化學誘變劑。袁艷玲等[52]對紫外誘變獲得的菌株H12進行DES誘變，得到中性蛋白酶高產菌株H12-5，蛋白酶活力由1 438 U/g提高至2 158 U/g，誘變效果顯著，為工業生產提供了性狀優良的菌株。盧燕云[53]對紫外誘變后篩選出的突變株UV-5進行DES誘變，篩選出蛋白酶活力高達601.7 U/g的突變株D-7，比出發菌株提高了49.76%。朱運平等[54]對米曲霉11250進行40 min的亞硝酸鈉誘變，其中突變株N4的柚苷酶活力最高可達168 U/mL，與出發菌株相比提高了166%。

化學誘變的形式多種多樣，但單一化學誘變劑誘變米曲霉的研究較少，多采用與其他誘變方法共同組合的方式[55]。化學誘變簡單易行，具有一定特異性。但化學誘變劑大多是有毒或致癌物質，安全性低，容易對人體產生危害，并且有益突變頻率低。因此，通常對米曲霉不單獨進行化學誘變，結合其他誘變方式進行復合誘變效果更佳。

4 原生質體融合

20世紀60年代，以遺傳學、分子生物學等學科為基礎并借助先進的實驗技術，原生質體融合技術應運而生。融合已知性狀供、受體菌的原生質體[56-57]，使得含所需表型的親本菌株進行重組[58]，遺傳傳遞更完整，效率更高[59]，可突破種甚至屬的限制，不受以往親緣關系的限制，加速微生物菌株的定向進化，進而獲得具有理想表型的工業菌株[60]，應用領域廣泛。

唐潔[61]利用原生質體的電融合技術，將長勢快、蛋白酶活性低的米曲霉AS3.951和蛋白酶活性高、長勢慢的米曲霉CICC2339進行遺傳改造，并將制備好的原生質體滅活后進行電融合。經過篩選，融合菌株EF113的產酶活力最高，超越了原始菌株CICC2339，達到7 680 U/g。Xu Defeng等[62]將米曲霉與黑曲霉進行基因組重組，成功地選育出了酸性蛋白酶產量有顯著提高的融合子，其中融合子F76產酸性蛋白酶活力接近1 500 U/g，比親本米曲霉菌株高82.19%，培養條件優化后酶活力提高至1 936 U/g。Wang Shenghai等[63]將米曲霉SBB201進行紫外線（ultraviolet，UV）/LiCl誘變后的兩個突變體UV-11和UV-76進行原生質體融合，經過3 輪的基因組重組得到融合突變體RIII-7，其果糖基轉移酶活力達到了180 U/g，約為原始菌株的2 倍，且遺傳穩定性較高；經發酵條件改進后，酶活力達到353 U/g，是原始菌株的3.4 倍。

原生質體融合技術是改良真菌遺傳變異的有力工具，是一種具有巨大潛力的表型快速改良技術，在工業上受到極大關注[64]。同時，利用融合技術選育的菌種，可以普遍消除菌體在經過誘變處理后出現的產量提升緩慢問題。隨著技術的革新，原生質體融合技術也解決了越來越多的雜交障礙。

5 復合誘變

菌株受到同一種誘變劑反復誘變時，會表現出抗性飽和現象[65]。例如，米曲霉滬釀3.042是野生型菌株經過多次紫外誘變獲得的，當誘變強度達到一定程度時，繼續提高菌株產酸性蛋白酶的活性變得更加困難。這可能是滬釀3.042菌株的誘變抗性飽和所致[66]。采用單一的誘變劑誘發的突變位點較為固定，往往達不到期待的誘變效果，因此，增加誘變劑的種類，更易獲得正向突變，提高誘變成功的幾率。

邵偉等[67]以米曲霉滬釀3.042為出發菌株，對其進行紫外-化學復合誘變后，經過篩選后得到一株蛋白酶活力很高的突變株A11，蛋白酶活力由3 447 U/g提高至3 668U/g，提高了6.41%。也有研究者對滬釀3.042的分生孢子先進行紫外-LiCl、亞硝基胍復合誘變，將所得的突變株再進行由聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導的原生質體融合，最終得到中性蛋白酶高產菌株，其中FII-41分泌的中性蛋白酶活力達7 412 U/g，比原始菌株提高1.76 倍[68]。米曲霉CS3.03經UV-DES進行復合誘變處理后，獲得遺傳性狀穩定的突變株P7，其蛋白酶的干基酶活力為4 994.18 U/g，比出發菌株增加了173.92%，有效提高了醬油釀造的氨態氮含量和全氮利用率[69]。于江[70]對米曲霉AS3.042進行UV-亞硝基胍復合誘變，誘變菌株ASQ-1的琥珀酸產量為初始菌的294 倍，進一步提高了醬油品質。

通過多項實驗研究證實，多種誘變方式協同作用于原始菌株，基因突變位點增加，可顯著提高微生物發生正向變異的概率，降低篩選工作量，縮短誘變周期，是微生物高效誘變育種中不可或缺的方法。

6 基因工程育種

2005年，日本聯合多家機構對日本米曲霉RIB40的基因進行了測序[71]，這是第一株完成全基因組測序的米曲霉，標志著米曲霉全基因組時代的降臨?；蚬こ碳夹g的發展進一步推動了米曲霉優良菌株的選育，在米曲霉功能基因表達中具有水解活性的酶種類最多，其次是氧化還原酶和轉運相關的酶，這也印證了米曲霉適用于食品發酵行業的原因。雖然大部分編碼基因的功能還未被證實，但根據已經被解析的信息可以看出，參與水解酶、氧化酶相關的轉錄、翻譯等生理活動極為活躍?；蚬こ虨榫晷阅芨脑焯峁┝诵滤悸贰?/p>

6.1 轉錄因子調控

簡單地分析菌體代謝物中的酶系表達情況，并不能完全反映菌體的生理活動，因其酶系的表達還受到相關轉錄因子的調控，要根據其宏觀上的表達差異追溯到微觀層面的變化。Tanaka等[72]發現，與野生菌株相比，缺失轉錄因子FlbC的米曲霉在固體培養中酸性蛋白酶和糖化酶的產量顯著降低，而中性和堿性蛋白酶的產量則沒有明顯變化。這一結果表明，FlbC在固態培養中只參與酸性蛋白酶和糖化酶的合成，但不影響中性和堿性蛋白酶的合成。固態培養條件下，對FlbC介導的基因表達調控機制的深入探究，有利于進一步提高米曲霉固態發酵生產的效率。

PrtR是一種編碼調節細胞外蛋白水解基因的轉錄因子基因，Mizutani等[73]使用構巢曲霉基因作為選擇標記物替換米曲霉的PrtR基因，發現該轉錄因子的缺失導致細胞外蛋白酶活力顯著降低?？梢缘贸觯琍rtR對調節菌體胞外蛋白酶的分泌不可或缺，可嘗試通過給PrtR轉錄因子更換不同類型的強啟動子，以探究能否進一步提高胞外蛋白酶活力。Takahashi等[74]將原生質體細胞2號染色體（2號染色體上包含蛋白酶轉錄激活因子prtT及編碼堿性蛋白酶和α-淀粉酶的基因）上的部分區域以斷裂誘導復制方式易位到其他染色體上，得到含有2號染色體目標區域的二倍體或三倍體菌株，對過表達菌株進行基因表達及表型分析，結果發現，在二倍體菌株中蛋白酶和淀粉酶活力均有顯著提高，在三倍體菌株中進一步增加；在過度表達蛋白酶的轉錄激活因子prtT后，二倍體和三倍體菌株的蛋白酶活性進一步增強。這表明在一定范圍內適當增加結構基因和調控基因的拷貝數可增強由此產生的表型。這些結果表明，PrtR/PrtT是調節胞外蛋白水解基因表達的關鍵作用因子。雖然蛋白質水解基因的表達是受蛋白質、多肽誘導，但是直接活化PrtR/PrtT的作用底物尚不明確[75]，有待進一步研究，若解析出直接底物則可能進一步提高胞外蛋白酶的分泌。

Hunter等[76]從米曲霉RIB40中刪除了creB基因，通過表型分析發現，一些水解酶活性有提高。在誘導物存在條件下，ΔcreB菌株的淀粉酶活力是原始菌株的2 倍多，纖維素酶和木聚糖酶活力較原始菌株分別提高50%和100%。Ichinose等[77]通過構建creA和creB雙缺失突變株，發現雙缺失后的ΔcreAΔcreB突變體木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活力比野生型菌株均高出100 倍以上，在固態培養中雙缺失突變體的β-葡萄糖苷酶活力比野生型菌株高7 倍以上，這些結果表明，creA和creB基因的缺失可有效提高米曲霉的水解酶產生水平。

綜上可以看出，調控酶基因的轉錄因子起著十分重要的作用，對于激活型轉錄因子可嘗試增加拷貝數或更換啟動子等方式來促進轉錄活動；同理，對于抑制型轉錄因子可考慮通過敲除、敲減等方式消除或減弱目標蛋白轉錄路徑的影響。轉錄因子的調控，或為促進胞外蛋白酶分泌的研究拓寬思路。

6.2 編碼基因異源表達

將米曲霉中編輯蛋白的基因在其他分泌能力更強的菌種中進行異源表達，分離純化得到最終的目標蛋白，可實現高表達特定酶的批量生產。如將酸性蛋白酶克隆到畢赤酵母中，在培養的上清液中檢測出酶活力達到50.62 U/mL[78]，為米曲酶酸性蛋白酶的異源表達提供了指導。

Kang Chao等[79]克隆了米曲霉中脯氨酰內肽酶（Aspergillus oryzaeprolyl endopeptidase，AO-PEP）基因并在畢赤酵母中表達，經分批高密度發酵，AO-PEP活力達到1 130 U/L；在啤酒釀造的發酵階段添加AO-PEP，能夠有效地降低啤酒濁度，提高啤酒的非生物穩定性，降低了為減輕濁度而添加聚乙烯基聚吡咯烷酮的操作成本。Yang Hongyu等[80]對米曲霉JN-412的脯氨酰氨肽酶（prolyl aminopeptidase，PAP）基因進行了密碼子優化并插入表達載體pPIC9K，導入巴斯德畢赤酵母中成功表達，其胞內酶活力達到61.26 U/mL，是野生型的2.1 倍。Salamin等[81]將脯氨酰羧肽酶基因（AoS28D）在米曲霉NF1中進行過表達，轉化后的菌株發酵后上清液酶活力最高可達到原始米曲霉NF1菌株的32 倍，極大提高了脯氨酰羧肽酶的表達量。

目前的技術手段不斷更新，米曲霉中功能基因實現外源表達的成功實例越來越多，這也加快了相關技術的更新換代，如Katayama等[82]確立了一套高效的米曲霉多重基因工程技術，促進了對工業菌株的多基因修飾。相信在未來，對于米曲霉中蛋白基因的異源表達將會有更大的進展，其蛋白酶類及其他代謝產物的工業化生產也將迎來新的發展階段。

6.3 組學技術應用

隨著基因組學、轉錄組學、蛋白組學等技術的發展，基因、蛋白、細胞或個體間實現網絡化連接，生物問題研究趨向層次化、系統化。將組學技術應用到菌種改造，可縮短育種時間、提高突變率、簡化操作步驟。米曲霉的基因序列雖然已完成測定，但仍存在大量編碼蛋白功能未知的問題。

Li Yuzhen等[83]通過對米曲霉3.042不同發育時段的轉錄組測序發現，一個未表征的基因（Aokap2）在米曲霉的生長和發育過程中表達受到抑制，為研究Aokap2的作用，將含有米曲霉amyB啟動子且Aokap2過表達的質粒pEX2B-Aokap2導入米曲霉ΔpyrG菌株。結果顯示，Aokap2基因表達量上調，米曲霉生長速度減慢，形成的孢子量減少，生物量降低了30%，曲酸產量增加了4 倍，Aokap2的發現為米曲霉生長和曲酸生產的基因改造提供了新的靶點，為其他菌種的研究提供參考。Jin Fengjie等[84]使用蛋白質組分析的方法探究參與控制生長和分化的轉錄因子SclR的功能，通過串聯質量標簽（tandem mass tag，TMT）標記ΔsclR突變株和對照菌株在液態培養下的胞內蛋白來實現蛋白半定量，結果顯示，SclR主要參與米曲霉的碳代謝、碳水化合物代謝、次生代謝物的生物合成等，同時經實時熒光定量聚合酶鏈式反應輔助驗證結果。組學技術應用將在未來的生物機理研究和工業生產應用中起到重要作用。

6.4 合成生物學技術

合成生物學結合了代謝工程和系統生物學概念，是各學科交叉融合發展的產物，旨在按照特定的目標設計、改造甚至從頭合成目的產物，經優化和轉化的生物體，可實現連續高效合成終產物的目標。Sakai等[85]將攜帶與桔霉素產生有關的pksCT、ctnA及4 個orf生物合成基因簇的粘粒CossCT轉化至米曲霉NS4，成功組建了米曲霉次生代謝物的異源生產系統，構建了含trpC啟動子控制的ctnA表達盒pNCtnA并將其導入轉化子，結果顯示菌株16-2reg4和16-2reg5中的桔霉素量為菌株16-2的400 倍。Brown等[86]將pgk啟動子與高表達的轉運蛋白基因C4T318構建質粒pShTh104并將其轉化到米曲霉NRRL3488，轉化子ShTh1040-22的蘋果酸產量提高2 倍；在此基礎上，將C4T318基因、丙酮酸羧化酶pyc基因和蘋果酸脫氫酶mdh3基因轉化到米曲霉NRRL 3488，轉化子SaMF2103a-68產蘋果酸質量濃度達154 g/L，結果說明pyc和mdh3基因加快了由丙酮酸轉化成蘋果酸的速度，促進蘋果酸的積累和葡萄糖產量的增加。

通過合成生物學技術的定向改造，突破自然進化的局限，設計、改造和搭建具有特定功能的生物體系，能夠緩解食物匱乏、環境污染、醫療資源和能源短缺等問題，因此，合成生物學在未來會有更廣闊的應用前景。

7 結 語

米曲霉被廣泛應用于食品釀造行業，如何有效提高其水解酶類活力或代謝物的合成能力成為重中之重。物理、化學、原生質體等誘變方式被廣泛應用，雖然一定程度上可以實現育種目標，但其龐大的篩選工作及育種方向的不確定性使育種工作進展緩慢。如何提高菌種誘變后篩選的簡易性和育種的正向突變概率是這些誘變方法改進的重要研究內容。從現在的發展趨勢來看，采用基因編輯技術對于菌株遺傳物質進行遺傳改造最為直接有效，基因工程育種通過分子層面對酶或代謝產物的合成機理進行根本性地挖掘，便于將來能夠更好地指導對優良米曲霉菌種的選育。隨著科技發展，可結合各種組學和合成生物學技術，優化米曲霉改造路線，針對性地設計和改造菌種，借助精密的儀器設備和高效的生物元件，實現準確靶向突變、提高突變位點的穩定性和安全性，為培育優良性狀的菌種提供相應的技術指導。