無細胞生物傳感器及其在食品與生物檢測應用中的研究進展

王佳佳，王 鑫，龐曉旭，黃昆侖,2，許文濤，羅云波,2，程 楠,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，食品質量與安全北京實驗室，北京 100083；2.農業農村部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083）

生物傳感器主要由分子識別和檢測信號輸出元件組成[1]，是用于檢測微量物質的工具，具有專一性強、準確度高、能在線分析等優勢[2-4]。近幾十年來，細胞生物傳感器以微生物全細胞作為識別元件[5]在污染物[6]、化學成分[7]以及微量元素[8]檢測等領域得到了快速的發展。然而，活細胞系統的復雜性導致其必然存在一些天然的缺陷，例如，細胞膜限制檢測范圍[9-10]、跨膜運輸使響應時間長[10]、實驗細胞釋放存在安全隱患[11]等。

生物技術的快速發展使生物學家可準確地改造生物基因，繼而生產出所需的生物大分子。而合成生物學發展前期，主要是基于細胞對蛋白質工程化設計，但復雜的活細胞生命系統、細胞的生長與預期計劃不一致等問題，極大地限制了合成生物學發展。為了打破這些限制，一項新的工程技術——無細胞合成生物學誕生了。無細胞合成生物學的發展促進了無細胞系統的開發，很好地彌補了細胞生物傳感器的缺陷。無細胞系統以DNA或mRNA作為模板，利用分離的細胞成分（例如核糖體和重組蛋白）或細胞粗提取物[12]，在開放的環境中添加反應底物、化學物質（可以是具有細胞毒性的物質[13]）和輔助因子進行轉錄和翻譯以表達蛋白質[14]，整個構建流程可在幾小時內完成[15]。此外，無細胞系統內的能量物質均用于目標反應，而非自我復制，極大提高了能量利用率[16]?；跓o細胞系統設計的無細胞生物傳感器還具有諸多優點[17]。例如，不需要活細胞生物參與控制，且不存在轉基因生物釋放問題[18]，便于戶外操作；可檢測細胞毒性物質[18]，檢測范圍更廣；運用了冷凍干燥技術可使無細胞體系具有較長的儲存期[19]；檢測限可以達到zmol級別[20]，靈敏度更高；當存在抑制或殺死活細胞的毒素時，系統也可正常運行[21]，具有良好的毒性耐受性；待測物可與識別元件直接接觸反應，從而更快產生信號[18]，大大縮短響應時間；沒有細胞生長等培養過程[22]，縮短生物傳感器構建時間。

本文對近幾年基于不同平臺的無細胞生物傳感器進行分類（表1），綜述了不同類型無細胞生物傳感器的研究進展，概述了無細胞生物傳感器在金屬離子、農藥與獸藥殘留等領域的檢測情況，旨在為無細胞生物傳感器的研究發展提供參考。

表1 無細胞生物傳感器在實際應用中的分類匯總Table 1 Summary of the applications of cell-free biosensors

續表1

1 無細胞生物傳感器

無細胞生物傳感器是在無細胞體系中進行，首先敏感元件（轉錄因子等）特異性識別并結合待測物，下游基因隨后被激活從而引發轉錄翻譯過程，最終輸出信號（例如顏色變化、熒光、電信號）[10]。如圖1所示，目前，基于不同平臺設計的多種無細胞生物傳感器被廣泛應用于環境檢測[9,28]、食品安全檢測[39,53]、疾病診斷[17,49]等領域。

圖1 無細胞生物傳感器原理Fig.1 Schematic diagram of the working principle of cell-free biosensors

1.1 識別反應機制

生物傳感器作為分析裝置，其核心是利用生物分子進行特異性識別機制[55-56]。隨著待測物種類增多，傳統的識別元件（如酶、抗體）在多樣化應用中受限，新型識別元件有待深入研究。以下將介紹幾種目前已用于無細胞生物傳感器的識別元件，為將來設計新的識別元件提供思路。

1.1.1 轉錄因子

轉錄因子是一種具有特定結構的蛋白質分子，可與基因特異性結合，并在特定的時間和地點以特定的強度調控基因的轉錄過程[57]，這種調控既可激活也可抑制。例如，轉錄因子ArsR響應金屬離子As3+[38]，當待測物中不存在As3+時，轉錄因子ArsR與啟動子的RNA聚合酶結合位點結合，從而阻止轉錄。當As3+存在時，ArsR會與As3+特異性結合，發生構象改變，繼而從RNA聚合酶結合位點脫落，RNA聚合酶方可與啟動子結合，進而下游基因表達，產生顏色變化；轉錄因子LasRV能夠對?；呓z氨酸內酯（acyl homoserine lactones，AHL）產生響應（圖2）[17]，當在無細胞體系中加入囊性纖維化患者痰樣時，基因LasR表達出的轉錄因子LasRV與痰樣中的AHL特異性結合，進而激活下游啟動子表達，產生熒光現象，檢測限為4.9 nmol/L。利用無細胞生物傳感器檢測僅需2.5 h即可觀察到樣品間的差異[17]，證明了無細胞生物傳感器用于快速檢測具有可行性。此外，當待測物沒有與其對應的配體時，可通過代謝酶將轉錄因子不可識別的待測物轉化成可檢測的配體進行檢測[30,34]。然而，轉錄因子存在會與除待測物以外物質反應的問題[10]，有待進一步研究。

圖2 AHL響應型LasRV生物傳感器原理示意圖[17]Fig.2 Schematic diagram of AHL responsive LasRV biosensor[17]

1.1.2 Toehold開關

Toehold開關是一種由兩條RNA組成的可編程工程元件[58]，利用發卡結構來隔離核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）和起始密碼子以阻止順式基因翻譯啟動[41]。Toehold開關因其較好的特異性以及可識別任意核酸序列，常被用作檢測核酸的無細胞生物傳感器識別元件。例如檢測呼吸道合胞體病毒亞型A和B（圖3）[42]，分別以呼吸道合胞體病毒亞型A和B為觸發RNA設計開關，當觸發RNA存在時，會與Toehold開關的立足點區域特異性結合，導致Toehold開關發生構象改變，暴露核糖體結合位點，從而激活β-半乳糖苷酶基因（LacZ）表達，產生從黃色到紫色的顏色變化。Toehold開關可以在布料、多孔氧化鋁等多種材料中運行[40]，為便攜性無細胞生物傳感器開發提供了多個選擇平臺。然而，Toehold開關存在鎖死或OFF狀態下的基因表達問題，限制了其發展。目前主要通過使用12 nts環并結合更穩定的莖或將環域減少到11 nts[46]，以減少Toehold開關OFF狀態下基因表達。

圖3 Toehold開關設計原理[42]Fig.3 Schematic diagram of the principle for designing Toehold switches[42]

1.1.3 核糖開關

核糖開關是在轉錄或翻譯水平上順式調控表達的RNA元件[59]，由可與小分子配體特異性結合的適配子和調控基因表達的表達平臺兩部分構成[60-61]。相較于反式作用RNA和蛋白質調節，基于核糖開關識別的傳感器只需調整一個DNA模板即可達到優化的目的[36]，操作更簡化。如圖4所示，在檢測水中氟化物時，當有氟化物存在時，核糖體開關與其特異性結合，發生構象改變，下游基因表達，產生熒光；當沒有氟化物時，核糖開關折疊成終止發卡結構，阻止下游基因表達，檢測限為50 μmol/L[36]。然而，由于用于合成核糖開關的工程信號模塊設計方法尚未完全明確，目前核糖開關數量有限[61]，基于核糖開關無細胞生物傳感器的相關報道也較少。

圖4 檢測氟化物的核糖開關無細胞生物傳感器示意圖[36]Fig.4 Schematic diagram of riboswitch cell-free biosensor for fluoride detection[36]

1.1.4 成簇規律間隔短回文序列及相關蛋白系統體系

成簇規律間隔短回文序列及相關蛋白系統（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated，CRISPR-Cas）是古生菌和細菌中特有的一種適應性免疫系統[62]，依賴于DNA/RNA-RNA識別和結合來對核酸序列特異性切割[63]，根據不同的Cas效應器（Cas9、Cas12、Cas13等），CRISPR-Cas生物傳感器系統有不同的剪切原理[64]，例如，CRISPR-Cas13a系統中，crRNA與Cas蛋白結合形成核糖核蛋白復合體（ribonucleoprotein，RNP），直接切割目標探針顯示熒光信號[65]。CRISPR-Cas系統具有易編程的特點，不僅可用于轉錄調控、基因編輯，還可以最小的成本將DNA雙鏈斷裂[63]，是目前無細胞生物傳感器領域中新引入的識別機制，例如利用CRISPR-Cas9設計鑒別兩種寨卡病毒菌種的無細胞生物傳感器（圖5）[46]，通過逆轉錄將觸發序列附加到基于核酸序列的擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技術擴增的病毒RNA上，Cas9切割具有PAM序列菌株的DNA片段，切割后的DNA片段無法與Toehold開關特異結合，而未切割DNA片段可與Toehold開關特異結合，促使下游Lacz基因表達，產生顏色變化，檢測限為1 fmol/L；利用CRISPR-Cas9檢測尿液或血液中RNA生物標志物[66]，一旦傳感器接觸到待測物的RNA，待測物RNA會與處于自阻遏狀態的gRNA發生雜交，釋放目標RNA并恢復與terR基因結合能力，繼而Cas9進行切割，從而使綠色熒光蛋白基因不再被抑制，熒光強度增加。由于gRNA的額外序列可被重新設計，該生物傳感器理論上擁有檢測多種RNA生物標志物的能力[66]，但CRISPR-Cas系統存在脫靶等潛在風險[67]，以其作為識別機制的無細胞生物傳感器還較為少見。

圖5 基于CRISPR-Cas9檢測寨卡病毒的無細胞生物傳感器原理[46]Fig.5 Schematic diagram of cell-free biosensor for Zika virus detection based on CRISPR-Cas9[46]

1.1.5 其他

除上述的識別機制外，還有其他新型識別元件，例如利用缺乏氨基酸的無細胞合成蛋白系統（cell-free protein synthesis，CFPS）設計無細胞生物傳感器定量檢測氨基酸[37]。CFPS具有開放性，即允許改變體系中各種成分的濃度或替換內源性成分（如同位素標記、非天然氨基酸、熒光標記tRNA、突變核糖體）[68]。當體系中缺少特定的氨基酸時，翻譯過程無法繼續，加入含有特定氨基酸的樣品后，翻譯繼續，產生熒光，檢測限為100 nmol/L。該過程無需化學處理或色譜分離，幾小時內即可準確測定出樣品中氨基酸滴度，為氨基酸的定量提供了更實惠、靈活的選擇。此外，還可利用抗生素氨基糖苷類與細菌30S核糖體亞基結合可抑制翻譯的原理設計無細胞生物傳感器檢測血清抗生素[48]。當抗生素不存在時，T3 RNAP mRNA翻譯出T3 RNAP，從而激活NanoLuc螢光素酶基因表達翻譯，產生發光信號；當抗生素存在時，T3 RNAP mRNA和NanoLuc螢光素酶翻譯受到抑制，導致信號減弱。雖然大部分傳感器具有識別機制，但也有傳感器不具有識別元件，例如利用抗生素抑制細菌蛋白合成檢測抗生素[47]。當抗生素不存在時，LacZ表達，合成β-半乳糖苷酶，發生顏色變化；當抗生素存在時，β-半乳糖苷酶合成受到抑制，顏色無變化。

1.2 信號輸出

1.2.1 比色信號

比色信號由于肉眼可見，常被用作無細胞生物傳感器的輸出信號。例如，LacZ表達產物可使黃色底物氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃糖苷變成紫色；兒茶酚-2,3-雙加氧酶基因（XylE）表達產物可使無色低成本底物焦茶酚變成黃色[38]。LacZ的檢測限略低于XylE[38]，且其表達產物β-半乳糖苷酶的催化速度快[40]，常被用作比色信號報告基因。然而，β-半乳糖苷酶是一種比熒光蛋白更大的蛋白質，轉錄翻譯需要更多的能量，從而降低了其生成量[69]。目前，Ma Duo等[20]提出將蛋白分為α與w兩部分，利用Toehold開關隔離LacZα序列，補充合成的LacZw不僅提高了β-半乳糖苷酶的生成量，還使檢測時間縮短了23 min。

1.2.2 熒光信號

熒光信號作為另一種常見的無細胞生物傳感器輸出信號，常用熒光蛋白和熒光RNA適配體進行熒光表達。熒光無細胞生物傳感不需要ATP來釋放熒光，穩定性高、操作簡單。并且，Lopreside等[26]通過實驗發現熒光信號比比色信號響應時間更短，檢測限更低。

熒光蛋白是一種可發熒光的蛋白質[70]。在特定激發光下，熒光蛋白發射光可用熒光計測量，且相對穩定、成熟時間短，因此常將其作為熒光生物傳感器首選。熒光蛋白種類豐富，包括綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、翡翠綠色熒光蛋白（emerald green fluorescent protein，EmGFP）等。

熒光RNA適配體是一類可與小分子熒光團結合的RNA。這些小分子熒光團與綠色熒光蛋白中發現的熒光團相似，通常是沒有熒光的，與其同源適配體結合后，會產生明顯的熒光現象。例如：菠菜適配體與3,5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮（3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone，DFHBI）結合產生綠色熒光[71]，西蘭花適配體與(Z)-4-(3,5-二氟-4-羥基亞芐基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-5(4H)-酮結合產生綠色熒光[72]，玉米適配體與3,5-二氟-4-羥基亞芐基-咪唑啉酮-2-肟結合產生黃色熒光[73]。熒光適配體即使熒光團被光漂白，也可以連續交換結合熒光團，產生熒光，具有比熒光蛋白更長的熒光壽命[74]。

1.2.3 生物發光

熒光素酶是一類在自然界中不需要激發光照射即能產生生物熒光的一類酶，可用于無細胞生物傳感器光信號輸出。在沒有信號背景情況下，熒光素酶具有極大的線性范圍（高達7～8 個數量級）[33]。Voyvodic等[34]利用螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因設計無細胞生物傳感器檢測可卡因，提高了信噪比。此外，NanoLuc熒光素酶具有高靈敏度和寬動態范圍[75]，也可用于無細胞生物傳感器設計[48]。

1.2.4 電信號

電信號利用電極捕獲物質產生電流或電壓變化進行檢測，可用作無細胞生物傳感器的輸出信號。Mousavi等[53]利用電極捕獲含有氧化還原標記的DNA產生電化學信號的原理設計無細胞生物傳感器（圖6）檢測抗生素耐藥基因，該傳感器利用不同的Toehold開關激活后產生不同的限制性內切酶，實現同時檢測多個抗生素耐藥基因的目的，檢測限為1 fmol/L。此外，Zhang Yan等[50]借助血糖儀讀數，結合代謝模塊設計無細胞生物傳感器檢測Zn2+。Zn2+與轉錄因子結合后，激活LacZ表達產生β-半乳糖酶，而β-半乳糖酶又將乳糖轉化為葡萄糖，從而能夠用血糖儀讀數，輸出電信號。

圖6 基于納米載體的多路電化學接口無細胞生物傳感器原理圖[53]Fig.6 Schematic diagram of multi-channel electrochemical interface cell-free biosensor based on nanocarriers[53]

1.3 生物傳感平臺

生物傳感平臺是傳感器反應的載體，目前報道的無細胞生物傳感器平臺有以下5 種。1）溶液平臺?；谌芤旱臒o細胞生物傳感器無需再經其他平臺，可直接進行信號讀取，并且成分在體系中分散更均勻。目前，基于溶液的無細胞生物傳感器的相關報道比較多，其發展已經趨于成熟。2）紙張平臺。通過冷凍干燥技術將細胞提取物、構建的基因網絡等嵌入到紙張上，以創建具有細胞基本轉錄和翻譯功能且無菌的紙張平臺?；诩垙埰脚_的無細胞生物傳感器在室溫下穩定、易于貯存、價格便宜，且只需加水即可激活[40]，已成為近幾年的研究熱點。3）電極平臺。該平臺生物傳感器將工程分子組件與電子產品結合[49]，通過翻譯板塊輸出葡萄糖，即可使用血糖儀進行數據讀取。這些傳感器不需再定制類似數據閱讀器的基礎設施，可降低成本。4）納米載體。作為2021年國家重點研發項目的納米載體具有放大信號[76]、催化反應[77]等優勢，但基于納米載體的無細胞生物傳感器目前還較為少見，有待深入研究。5）微流體平臺。微流體可使用微小通道來處理少量樣品，具有能夠縮短分析時間、減少昂貴試劑使用等優勢，然而這類無細胞生物傳感器的報道同樣比較少。盡管目前無細胞生物傳感平臺不再單一，但除溶液外的平臺研究還較少。未來一段時間內，進一步開發提升檢測效率且便攜的無細胞生物傳感平臺或成為該方向研究重點。

2 無細胞生物傳感器在實際檢測中的應用

2.1 金屬離子檢測

環境和食品中的化學污染物金屬離子威脅著人類的生存和健康，金屬離子含量高，會導致許多健康問題發生。

Pellinen等[9]早在2004年就以轉錄因子識別采用熒光素酶作為輸出信號建立無細胞生物傳感器檢測Hg2+，然而并沒有給出檢測限。隨著研究的深入，直到2019年，Gupta等[33]則將熒光素酶換成熒光蛋白設計傳感器檢測Hg2+，給出的檢測限為1 μg/L。同年，Zhang Peng等[18]也在先前的工作基礎上設計熒光無細胞生物傳感器并檢測了新的金屬離子As3+，其檢測限為661.005 nmol/L。由于溶液平臺的無細胞生物傳感器攜帶不便，Gr?we等[39]設計了基于紙張的熒光無細胞生物傳感器檢測Hg2+，并開發了一種與智能手機相結合的雙濾鏡系統，使戶外檢測更加方便，檢測限為6 μg/L。

目前，無細胞生物傳感器已用于檢測Pb2+[28]、Zn2+[28,50]、Cu2+[28]、As3+[18,32,38]、Hg2+[9,18,26,33,39]和Cd2+[28]，其中檢測Hg2+的研究較多，但其識別機制還局限于轉錄因子，檢測金屬離子種類有限，與便攜設備聯用比較少。因此，用于檢測金屬離子的無細胞生物傳感器未來可探索新的轉錄因子或識別元件，進一步擴大檢測范圍；與血糖儀、智能手機、3D打印裝置等便攜設備結合使用，使數據讀取更加精準方便。

2.2 農藥和獸藥殘留檢測

農藥和獸藥的過度濫用會導致其殘存于環境、動植物體內或其代謝物中，對水土資源及食品造成污染，給人體健康帶來危害。

Pellinen等[9]以熒光素酶基因構建的轉錄因子識別無細胞生物傳感器用于檢測四環素，檢測限為10 ng/mL。隨著無細胞生物傳感器的發展，Jung等[28]利用熒光適配體設計的傳感器檢測四環素等污染物并應用于實際市政水樣檢測。此外，Silverman等[30]利用除草劑阿特津通過酶的作用可轉換為氰尿酸的原理設計熒光無細胞生物傳感器檢測水樣中阿特津，檢測限為20 μmol/L，但是，并沒有達到美國環境保護局對阿特津3 μg/L的檢測限要求。隨著對無細胞生物傳感器平臺的研究深入，低成本的紙張無細胞生物傳感器開始出現。Duyen等[47]開發了一系列基于紙張的無細胞生物傳感器，利用抗生素抑制β-半乳糖酶合成的原理，檢測抑制細菌蛋白合成的抗生素帕羅霉素、四環素、氯霉素和紅霉素，其檢測限分別為0.5、2.1、0.8 mg/mL和6.1 mg/mL，并對真實水樣進行了檢測。為使數據讀取更加方便準確，Amalfitano等[49]則結合血糖儀設計無細胞生物傳感器檢測四環素。

目前，已有基于溶液[9,28,30]、紙張[47-48]、納米載體[53]和電極[49]平臺的無細胞生物傳感器檢測農藥和獸藥殘留，其中多數是檢測水樣中的抗生素，最低檢測限為10 ng/mL，檢測樣品比較單一。未來，進一步提高無細胞傳感器的特異性，將其應用于復雜的食品樣品檢測，可促進食品安全檢測領域的快速發展。

2.3 病毒檢測

近些年來，由病毒引起的疾病具有極高的發病率，利用無細胞生物傳感器快速、靈敏、簡便的優點檢測病毒，已在臨床診斷領域發揮功效。

Pardee等[40]構建的基于Toehold開關識別紙張無細胞生物傳感器可肉眼檢測埃博拉病毒，檢測限為3 nmol/L。2016年，他們在先前構建的無細胞生物傳感器的基礎上，對Toehold開關進行了優化，并利用CRISPR-Cas9作為識別元件區分血漿中的不同的寨卡病毒毒株[46]。2018年，Ma Duo等[20]首次將磁珠技術用于無細胞生物傳感檢測的樣品前處理，對糞便樣本中的諾如病毒進行富集，使檢測靈敏度提高了1 000 倍，檢測限為270 zmol/L，盡管此設計可檢測諾如病毒GII.4基因型，但無法檢測近些年比較流行的GII.17基因型。Sun Qiuli等[43]則解決了這一問題，他們基于此前研究設計的紙張比色傳感器可區分GII.4與GII.17基因型，檢測限分別為0.5 pmol/L、2.6 fmol/L。NASBA是病毒檢測常用的擴增技術，需要1～3 h。為縮短擴增時間，Park等[44]提出用逆轉錄環介導等溫擴增（reverse transcription loop-mediated，RT-LAMP）技術代替NASBA，對唾液中的冠狀病毒進行處理，檢測限為3 fmol/L。此外，Nguyen等[45]將設計的檢測埃博拉病毒的無細胞傳感器置于兩層親膚的硅膠材料中間，實現了可穿戴目的。無細胞生物傳感器也可與現有的數據讀取設備結合，例如血糖儀。Tang Yidan等[51]利用轉化酶可將底物蔗糖轉化為葡萄糖，通過設計含有轉化酶基因的Toehold開關識別寨卡病毒，最終通過血糖儀進行數據讀取，檢測限為20 copies。Amalfitano等[49]則選取海藻糖酶作為轉化酶設計無細胞生物傳感器檢測嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2），檢測限為100 copies。

目前，基于病毒檢測的無細胞生物傳感器設計流程較為成熟，通常基于紙張平臺對病毒進行核酸擴增-Toehold開關識別-輸出比色信號-便攜設備數據讀取。相較于傳統的病毒檢測手段，基于紙張的無細胞生傳感器方便攜帶，不需要專業人員和大型儀器，在快速檢測領域極具應用前景。

2.4 群體感應分子檢測

群體感應（quorum sensing，QS）一直是食品安全和環境領域的研究重點，利用QS分子（包括AHL、N-3-氧十二烷基-L-高絲氨酸內酯等）可以開發控制細胞間通訊的藥物和潛在抗菌劑[78]。QS是細菌通過對自身誘導物信號產生、釋放和濃度的感應來調節基因表達的能力[23]。

Kawaguchi等[23]報道了一款基于轉錄因子識別的比色無細胞生物傳感器可快速篩選群體感應分子中的AHL，通過肉眼即可看到顏色變化，檢測限為100 nmol/L。而Yang等[27]則以熒光作為信號輸出設計無細胞生物傳感器篩選與腔鏈霉菌群體受體蛋白相互作用的群體感應分子。無細胞生物傳感器不僅能用于群體感應分子的篩選，還可以用于檢測臨床樣本，判斷患者病情。Seto[54]設計的無細胞生物傳感器可快速檢測患者是否感染病理性銅綠假單胞菌。在銅綠假單細胞菌的毒性作用下，N-3-氧十二烷基-L-高絲氨酸內酯使轉錄蛋白從啟動子中解綁，從而允許下游基因表達，產生熒光信號。

目前，利用無細胞生物傳感器檢測群體感應分子的報道還是比較多的，檢測樣本覆蓋水樣[18]、痰樣[17]、細菌[27,54]。然而，其識別機制還限于轉錄因子。探索檢測群體感應分子新的識別元件用于無細胞生物傳感器設計，將是未來重點的研究方向。

2.5 其他

除上述外，無細胞生物傳感器還用于苯甲酸鹽、內分泌干擾素、氨基酸的檢測以及教學工具的設計。苯甲酸鹽是一種常見的食品防腐添加劑，其在食品中最高含量限制為0.1%。若向含有抗壞血酸的飲料中添加苯甲酸鹽，苯甲酸鹽會轉化為低水平的苯（一種強致癌物）[16]，運輸過程中溫度的升高亦可增強反應。因此，Voyvodic等[34]設計了一款無細胞傳感器可以100%準確區分哪些飲料中含有苯甲酸鹽。內分泌干擾素是一類能擾亂生殖系統的化學物質。Salehi等[24]設計了基于轉錄因子甲狀腺受體識別的無細胞生物傳感器，用于檢測內分泌干擾素?；诩毦鷻z測內分泌干擾物需要24～36 h，而該生物傳感器只需要不到30 min就可以得到結果。此后，他們將甲狀腺受體結合域替換為雌激素受體結合域設計生物傳感器檢測血液與尿液中的內分泌干擾素雙酚A、β-雌二醇與二乙基丙腈[25]，檢測限分別為330、26 nmol/L和9 nmol/L，比同類細胞生物傳感器檢測效果更好。缺乏氨基酸會導致生理功能異常，影響抗體代謝，因此氨基酸可作為多種癌癥早期診斷的指標。Jang等[37]報道了無細胞生物傳感器檢測氨基酸。此后，Jang等[52]又對其進行改進，與血糖儀結合使用，使其操作更方便。生物標志物是可標記細胞、組織器官等的結構或功能發生改變或可能發生改變的生化指標。Takahashi等[41]設計的低成本紙張無細胞生物傳感器檢測臨床糞便樣本中的生物標志物mRNA，檢測限為30 amol/L～3 fmol/L。無細胞生物傳感器不僅可用于物質檢測，也可作為教學工具輔助生物學習，Huang等[35]設計了檢測香蕉和獼猴桃DNA的教學工具，便于學生對生物學的理解。

3 結 語

綜上，無細胞生物傳感器的研究日漸增多，其發展也越來越成熟。目前，多種平臺已用于構建無細胞生物傳感器，平臺覆蓋了溶液、紙張、電極、納米載體、微流體。無細胞生物傳感器已在水樣、血清、尿液等實際樣品中應用，但對于食品等復雜實際樣品檢測的應用還比較少，這或許是后續工作可以重點關注的領域。

隨著樣品檢測需求日益增加，無細胞生物傳感器依然面臨巨大的挑戰：1）實際樣品的復雜性，含有多種成分會干擾無細胞生物傳感器的檢測。為提升無細胞生物傳感器檢測的準確性，可尋找新的識別元件或設計更為高效的開關或優化無細胞體系等有效的措施提升無細胞生物傳感器的靈敏度和特異性；2）目前用于無細胞系統的主要是大腸桿菌提取物，未來可以基于真核生物的提取物設計靈敏度更高、更為實用的生物傳感器；3）實際樣品檢測單一，無細胞生物傳感器目前大多數還是檢測水樣和血清，對于多樣化實際樣本的檢測是未來的檢測應用方向；4）目前基于無細胞生物傳感器的研究方向比較單一，多集中于液相平臺和使用轉錄因子識別，因此研究多樣化識別元件和平臺是未來發展趨勢。綜上所述，無細胞生物傳感器展現出了極大的檢測應用潛力，隨著進一步的研究開發，便攜、靈敏的無細胞生物傳感器有望在醫學、食品、環境等領域中投入應用。