果膠寡糖的制備、分離純化及其生物活性研究進展

孔 慧，張達莉，徐海山，傅鑫程，王蓉蓉，單 楊，丁勝華,*

（1.湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業科學院農產品加工研究所，果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125；3.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128）

果膠是一種結構非常復雜的多糖，平均相對分子質量為50～300 kDa，主要存在于高等植物細胞壁中[1]。果膠的分子結構分為光滑區和毛發區，光滑區由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵聚合形成線性主鏈，毛發區由高度分支的L-鼠李半乳糖醛酸構成主鏈，阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖等中性糖組成側鏈[2]。果膠主要由聚半乳糖醛酸（homogalacturonan，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖（rhamnogalacturonan，RG）-I、RG-II和木聚半乳糖醛酸（xylogalacturonan，XGA）等結構域組成[2-6]，這些結構域相互結合形成不同結構的果膠，因此活性也存在差異。果膠在水果及其殘渣中（柑橘皮（30.0%）、檸檬皮（23.8%）、蘋果肉（20.9%）、芒果（21.0%）和山楂（10.3%）[7]）含量豐富，市售商品果膠主要為柑橘果膠和蘋果果膠。我國食品行業對果膠需求量很大，每年消耗量在4 000 t以上，但其中80%依賴進口[8]，主要是因為我國果蔬副產物加工利用率低，大部分加工副產物未得到充分利用，潛在經濟價值亟待挖掘開發。近年來，有研究報道，柑橘罐頭加工的脫囊衣酸堿廢水也是提取回收果膠新的重要來源[9-12]。

果膠具有良好的增稠、穩定、膠凝、乳化等特性，在食品工業中可用作多種食品添加劑。同時果膠作為一種天然、安全的多糖，具有多種生理活性，如促進腸道蠕動、降血脂、降膽固醇、吸附重金屬離子[13-15]、抗腫瘤[16]、抗癌[17]、抗氧化[18-20]、抗菌[21]和作為益生元等，被廣泛應用于食品、醫藥、化工等行業。天然果膠分子質量大、溶解性差，不易被人體吸收利用，限制了其生物活性的發揮和在功能食品中的應用[22]。而果膠寡糖（pectic oligosaccharides，POS）是由天然果膠降解得到的一種分子質量較小、溶解度較高的低聚寡糖，結構更加明確，不僅更容易被吸收[23]，而且具有更強的生物活性[24]。大量研究表明，在不同制備條件下，會得到一系列不同分子質量和結構的POS。而POS的生物活性與其分子質量及結構之間存在著密切關系。因此，探究如何制備適合分子質量大小和結構的POS成為當今的研究熱點。本文以POS為主要研究對象，綜述了POS的制備、分離純化、結構鑒定方法及其生物活性等方面的研究進展，旨在為POS的研究應用提供理論參考。

1 POS的制備

目前POS的制備方法包括3 種：從天然原料中直接提取法、化學合成法及降解法。直接提取法是獲得POS最初的手段[25]，但由于直接提取法得到的提取物成分復雜、分離困難，導致該法未廣泛應用。化學合成法因合成線路繁瑣、副反應多、難以分離純化[26]，目前還未實現工業量產。而果膠來源廣泛、價格低廉，因此，選擇合適的方法進行降解是目前制備POS的主要途徑。按照作用原理，POS的降解制備方法包括物理法降解、化學法降解、酶法降解和聯合法降解。

1.1 物理法降解

1.1.1 超聲降解

超聲降解的主要機理是利用超聲波（ultrasound，US）產生劇烈的空化效應和機械效應（擾動、高剪切、破碎和攪拌等），使物料周圍的水或氧分子分解為·OH、H·和HO2·等活性自由基[27]（反應式（1）～（3）表示US作用），引發有機物高溫水解、化學鍵斷裂、自由基氧化等反應，從而發揮其降解效應。超聲不會產生二次污染，具有環保、溫和、省時、低成本等特點，已被廣泛應用于果膠的降解改性研究中[28]。

超聲降解果膠受多種因素的影響[29]，如超聲強度[30-31]、超聲溫度[32]、超聲時間[33]、pH值[34]和占空比[32]等（表1）。Qiu Wenyi等[30]研究結果表明超聲強度越高，半柔性果膠在水溶液中的分子和構象參數變化越大。Yan Jingkun等[34]對柑橘果膠在不同pH值（4.0、7.0、10.0）條件下進行超聲處理，發現在高pH值下進行超聲處理會導致果膠特性黏度和重均分子質量（mw）的降低更為顯著。一般超聲效應隨超聲強度、溫度的增加和時間的延長而升高，但不會無限增加[35]。Zhang Lifen等[32]發現超聲強度過高或過低均不利于反應進程，當溫度從5 ℃升高到45 ℃時，超聲效應會有所下降，表明低溫下超聲效應更顯著。Liu Donghong等[36]的研究也得出類似結論。由于在長時間或高強度的超聲場下，能量在傳遞過程中逐漸衰減，導致該法降解能力有限，只能產生大于20 kDa的POS，因此通常將其作為一種輔助降解手段[37]。

表1 超聲降解法制備POSTable 1 POS preparation by ultrasonic degradation of pectin

1.1.2 輻照降解

輻照降解作為輻照技術的一個分支，也是一種制備POS的有效方法[40]，其主要機理是高能射線作用于果膠時，能夠打斷分子間的連接鍵形成自由基，引發糖苷鍵斷裂，破壞分子鏈的結構，從而使果膠發生降解[41]。影響輻照降解的因素有輻照源、輻照劑量、溫度、時間和pH值等，其中輻照源對輻解有直接影響。微波、60Co γ射線、電子束、紫外線等應用廣泛，γ射線、微波輻射穿透能力較強，為100 mm，其次是電子束輻射（l～10 mm），紫外線的穿透能力小于0.1 mm[42]。使用不同的輻照源，果膠的輻解程度和產物種類也會有所差異。

微波是一種頻率為300 MHz～300 GHz的電磁波，其熱效應能夠導致果膠糖苷鍵斷裂，引發降解，具有受熱均勻、處理時間短、綠色環保等優點[43]。近來有研究報道，微波降解果膠過程還伴隨著微波非熱效應[44-45]，但具體是哪種非熱效應導致果膠降解，機理如何，還有待進一步探究。以60Co為γ射線源的輻解具有高效、簡潔等特點，在果膠降解應用上的優勢得以突現。Kang等[46-47]采用60Co γ射線對柑橘果膠進行20 kGy劑量的輻照處理，得到了分子質量小于10 ku的POS。Gamonpilas等[48]利用電子束降解柚子皮果膠，輻照劑量為3～250 kGy，結果表明電子束輻照劑量越高，分子質量越低。電子束輻解不依賴60Co等放射源，且處理時間短，因此被認為比γ輻射技術更安全、更經濟。但電子束輻照的一個主要缺點是穿透深度不夠[49-50]。此外，還可利用紫外線（ultraviolet，UV）作為輻射源來降解果膠[51-52]。相對常規降解工藝而言，輻照降解具有操作簡單、綠色環保、降解效率高等優勢，但輻照降解法也存在技術門檻高、綜合投資大等限制因素。

輻照降解法制備POS的研究匯總如表2所示。

表2 輻照降解法制備POSTable 2 POS preparation by radiation degradation of pectin

1.1.3 高壓降解

高壓處理分為靜高壓技術和動態高壓技術，靜高壓處理不會引起果膠主鏈的降解，而動態高壓處理時，果膠會發生降解[55]。因此，目前通過高壓降解制備POS主要是采用動態超高壓均質（dynamic high pressure homogenization，DHPH）和動態超高壓微射流（dynamic high pressure micro-fluidization，DHPM）（表3）。其中DHPH在食品、藥品和化妝品等行業中早已得到廣泛應用[56-57]。近年來，DHPH也越來越多地用于果膠的降解研究中。徐柔[58]采用DHPH處理秋葵果膠后其分子質量從542 kDa降至277 kDa，粒徑從4 835 nm減至1 710 nm，并發現80 MPa處理后的果膠分子質量分布最為均勻，溶液更為穩定。DHPM是一種新興的動態高壓均質技術，其作用機理是在高壓環境中，果膠受到高頻振蕩、強剪切力、空化和渦旋等作用，引起機械性超微粉碎[59-61]，該技術可在低溫、短時間內即可實現，對物料處理能起到很好的超微化、微乳化和均一化效果[62]。Chen Jun等[59]采用DHPM降解蘋果果膠，發現隨著壓力的升高，果膠的表觀黏度、平均分子質量和粒徑逐漸降低。帥希祥[60]利用DHPM處理低酯和高酯果膠，結果表明它們的降解主要緣于分子內糖苷鍵的斷裂，沒有發生去酯化和消除反應。然而，DHPM技術所需裝備投資大、成本高，這限制了其在工業化大規模生產中的應用。

表3 高壓降解法制備POSTable 3 POS preparation by high pressure degradation of pectin

1.1.4 熱液處理

熱液處理是采用水熱壓縮法制備POS[55]，該方法只用水作為處理介質，具有綠色環保的優點[65]。Martinez等分別以蘋果渣[66]和橙皮[67]為原料，在160 ℃、嚴重因子（Ro）為288 min的條件下對其進行水熱處理，POS得率分別為29.7 g/100 g和25.1 g/100 g。姜美云等[68]采用水熱法降解果膠，在最優工藝條件下（140 ℃、pH 6、30 min），果膠降解產物得率達46.2%，并分離純化得到3 種寡糖，mw分別為13.4、7.5 kDa和5.7 kDa。亞臨界水處理也屬于熱液處理法，利用高溫高壓條件下亞臨界水所具有的強降解能力，可很好地從天然產物中獲得降解產物[69]。陳劍兵[70]利用亞臨界水處理柑橘果膠，105、120、135 ℃處理后得到的果膠mw分別為50、20 ku和10 ku，其中120 ℃亞臨界水處理是制備低分子果膠的較好方法。Klinchongkon等[71]在不同溫度（100、120、140 ℃和160 ℃）和升溫速率（3.5 ℃/min和7.0 ℃/min）下水解西番蓮果膠，結果表明隨著亞臨界水解程度的增加，果膠的黏度和相對分子質量逐漸降低，分子質量從197 kDa降到3 kDa。

此外，脈沖處理[72-73]和機械處理[74]（如研磨、擠壓、脫水）等物理法也可以使果膠發生降解，但并不常用。物理法降解具有操作簡單、環保無污染、較少試劑用量的特點，常用于制備POS，但降解作用不明顯，降解能力有限，通常將其作為輔助手段與其他降解方法聯合使用。

1.2 化學法降解

1.2.1 酸法/堿法水解

酸水解法是果膠糖苷鍵的氧原子發生質子化過程，常用的水解酸有三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙酸、硝酸、鹽酸（HCl）等（表4）。Round等[75]使用酸水解和原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）觀察發現，HG作為一種側鏈存在于果膠中，其最小平均尺寸約為之前報道的3 倍[76]。Zhang Shanshan等[77]通過改變TFA的濃度，獲得了3 種柑橘皮POS，且酸性單糖的相對含量從68.58%增加到89.93%。而堿水解法主要是由氫氧化鈉、氫氧化鉀等水解堿引起皂化反應，降低果膠的酯化度，對其分子質量影響不明顯，因此并不常用。酸法/堿法操作簡單、成本低，但需使用大量強酸、強堿等化學試劑，反應條件劇烈，對環境不友好。

表4 酸水解法制備POSTable 4 POS prepararation by acid hydrolysis of pectin

1.2.2 氧化降解

相比于酸法/堿法降解，氧化降解法條件相對溫和，降解速度快，產生的副產物和污染物較少。它通常利用過氧化氫（H2O2）、次氯酸鈉等強氧化劑降解果膠，即在酸性條件下，氧化劑被分解產生大量自由基（·OH、O2-·），引發自由基鏈式反應，使果膠糖苷鍵斷裂發生降解[81]。

H2O2氧化降解果膠的終產物為水和氧氣，具有高效、綠色的特點，已被證明是一種制備POS的有效方法[82-83]。為提高H2O2產生自由基和降解的速率，有研究將Cu2+[7]、Fe2+[84]等二價金屬離子作為催化劑加入反應體系中（表5）。H2O2和二價金屬離子組成的試劑被定義為Fenton試劑，該反應被稱為Fenton反應[7]。Fenton氧化降解果膠的機理是在Cu2+、Fe2+等的作用下，H2O2產生的大量·OH優先攻擊果膠HG區域，使得RG-I區域富集（圖1）。Li Junhui等[85]采用Fenton體系對柑橘罐頭加工廢水中回收的果膠進行降解，得到6 種低分子質量POS組分。Yeung等[86]利用Fenton反應在不同FeSO4濃度條件下降解秋葵果膠，結果表明隨著FeSO4濃度的增加，POS的分子質量逐漸降低，這與Zhi Zijian等[87]研究結果一致。Fenton氧化降解反應雖然速度快，但后續還需要使用金屬螯合劑等去除金屬離子才能得到高純度的降解產物。此外，在H2O2體系中加入抗壞血酸（VC）也可以提高降解速率[88-90]。劉閃閃[7]通過對羥自由基含量的測定驗證了較低濃度的VC（10 mmol/L）對H2O2有輔助降解作用。

圖1 Fenton反應降解果膠的機理[98]Fig.1 Mechanism of pectin degradation by Fenton reaction[98]

表5 氧化降解法制備POSTable 5 POS preparation by oxidative degradation of pectin

臭氧（O3）作為一種強氧化劑，可用于徹底氧化降解有機物。O3氧化降解具有綠色高效、反應過程可控、原料來源充足等優點，已廣泛用于污水處理[91]、環境消毒殺菌[92]和食品防腐保鮮[93]，以及大分子淀粉改性[94]等方面。因此，有研究者也將O3用于果膠的可控降解制備POS。Zimin等[95]發現蘋果果膠在H2O2（1.25%）/O3-O2混合物、70 ℃條件下氧化60 min，分子質量從125 kDa降低到6.4 kDa。肖中平等[96]通過控制反應條件（壓力0.1～1.0 MPa、溫度20～50 ℃、pH 3～10）和臭氧發生的通量（基于多糖固體質量計為10～500 mg/g），可以高效、可控地進行果膠的降解反應，以高收率獲得期望分子質量范圍（1～100 kDa）的寡糖。最近，Lupascu等[97]將20 g果膠在雙氧水中均質，并通過O3-O2（鼓泡率為10 L/min）的混合物處理60 min，得到了具有優異離子交換能力的低分子質量果膠，可用于去除重金屬和放射性金屬離子。由此可見，O3氧化降解有望成為一種綠色無污染的制備POS的有效方法。

1.2.3 光催化降解

光催化降解主要依賴于鈦氧化物（TiO2）作為催化劑產生活性氧，氧化多糖鏈中的單個糖殘基來降解果膠。TiO2在光化學反應發生后可通過離心或過濾去除，是一種環境友好的光化學反應[99]。Burana-Osot等[100]以TiO2作為催化劑，利用紫外光化學反應部分解聚果膠，結果表明，在pH 7的條件下，經6 h的紫外光光解作用，果膠平均分子質量從400 kDa下降到200 kDa；并發現降解后的果膠結構完整，幾乎不發生變化，解聚產物的分子大小可由紫外光照射時間和pH值調控。

1.3 酶法降解

酶法降解是利用特定酶切斷糖苷鍵對果膠進行降解，從而得到小分子POS[101-102]。酶法降解因能夠在溫和條件下進行區域選擇性解聚而變得越來越重要。目前已經開發出多種果膠降解酶，極大地推動了果膠結構的研究進程。根據底物和反應機制的不同，可將果膠降解酶分為4大類：原果膠酶、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectin lyases，PL）和果膠酯酶（pectinesterase，PE）。不同類型的果膠降解酶與果膠的作用方式不同，最終降解產物也隨之不同，如圖2所示[103]。

圖2 果膠酶對果膠的降解途徑[103]Fig.2 Degradation pathways of pectin by pectolytic enzymes[103]

果膠酶是能夠水解果膠物質的多種酶的總稱，可以從植物或微生物（如細菌和真菌等）中分離獲得，但來源于植物的果膠酶存在許多不足，如產量低且不易分離、提取與純化，所以較難實現大規模生產[104]。目前，由于微生物具有生長條件簡單、生長速度快和分布范圍廣等特點而成為生產果膠酶的優良生物資源[105]，包括青霉（Penicillium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、曲霉（Aspergillus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、囊酵母（Zygoascussp.）等。如表6所示，不同的微生物和發酵條件生產果膠酶的能力也不同。Meneghel等[106]評估了Aspergillus oryzaeIPT-301在限制和非限制氧氣供應條件下生產果膠酶的能力，結果表明較低的pH值更有利于果膠酶的產生和穩定性。盧曉華等[107]通過優化菌株XHV25的發酵產果膠酶條件，使其活力提高了65.11%。合成果膠酶的能力廣泛存在于所有微生物群中，但絲狀真菌類是首選，如黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma）、根霉（Rhizopus），因為多達90%的果膠酶可以在培養基中產生[108]。然而，真菌具有生長速度緩慢等限制因素。因此，商業用途迫切需要更高產果膠酶的新型分離菌株，進一步為采用酶法降解果膠提供基礎。

表6 果膠酶生產發酵條件Table 6 Fermentation conditions for pectinase production

酶法降解具有專一性高、反應條件溫和、副反應少、降解速度快等特點，可實現對果膠的定向和可控降解，成為近年來一種很有吸引力且廣泛應用的方法，部分酶法降解制備POS的研究匯總如表7所示。由于曲霉具備特有的安全性，其代謝物也是安全無害的，在酶法制備POS中得到了廣泛應用。Lemaire等[114]采用來自尖孢曲霉（Aspergillus aculeatinus）的3 種新型果膠酶降解果膠，發現RHG-GAN酶通過改變RG-I主鏈和支鏈結構來降低其黏度。POS的酶法制備會受到酶濃度和酶與底物接觸時間等因素的影響。Babbar等[115]發現不同濃度的內聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，EPG）-M2產生不同聚合度（degree of polymerization，DP）的POS片段，當EPG-M2濃度為2.6 IU/mL時，DP2和DP3在75～90 min的時間范圍內獲得最高產量；相比之下，在15～30 min內，用5.2 IU/mL可獲得最大DP4產量，為處理生物量干質量的5.2%～5.5%（質量分數）。此外，酶膜生物反應器常被用于酶解法制備POS，它屬于生物催化反應器和膜工藝（如超濾（ultrafiltration，UF））的綜合應用，允許產品在滲透時持續分離，確保POS不被進一步水解，并防止單糖形成，同時實現更高的POS產率。Baldassarre等[116]以洋蔥皮為原料，采用一種基于跨流連續酶膜生物反應器連續生產POS，該工藝采用一種復合纖維素酶與截留分子質量（molecular weight cut-off，MWCO）為10 kDa的膜，能夠獲得穩定的POS產率（22.0 g/（L·h）），與之前分批獲得的黏菌酶L的結果相比，酶膜生物反應器提供了3～5 倍的體積生產率。但由于果膠結構復雜，果膠酶種類多樣，該法對酶的活性、特異性和純度的依賴較強，對于某些特定酶難以分離和實現工業化生產[117]。目前，這種方法多用于實驗室研究。

表7 酶法降解制備POSTable 7 POS preparation by enzymatic degradation of pectin

1.4 聯合法降解

在對果膠進行降解制備POS的研究中，往往不是單一地使用一種方法，而是聯合使用兩種或多種方法，產生協同作用，進而達到更高效的降解目的。聯合法更多地是利用物理法中的US法與酶法、酸法或氧化法結合對果膠進行降解（表8）。牟方婷等[124]報道，US和微波處理均能有效提高果膠酶的降解效率，且US、微波作用顯著提高了半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）的含量。Larsen等[125]發現，與單獨超聲或酶處理相比，超聲輔助酶浸漬法水解果膠后的產物含量有顯著差異，US先將果膠分割成中等分子質量的少支聚物，再通過果膠酶進一步降解。

表8 聯合法降解制備POSTable 8 POS preparation by degradation of pectin with combined treatments

氧化降解法中的H2O2和Fenton試劑用量較高，為解決此問題，有研究者在H2O2或Fenton體系中引入了US輔助降解果膠。US的機械作用和微射流作用起到攪拌和傳質的作用，產生協同效應，不僅可減少氧化試劑的用量、降低成本，還能加快反應進程、縮短反應時間。Hu Weiwei等[126]利用US-NaHCO3-H2O2體系降解果膠，50 min內果膠的分子質量從1 088 kDa降至33 kDa。Zhi Zijian等[22]聯合US-Fenton降解法制備了RG-I富集的超低分子質量POS，發現超聲協同提高了Fenton反應的效率，可在35 min內將果膠分子質量從448.0 kDa降至5.5 kDa。另外，Fenton降解體系還存在一個問題，即引入了過渡金屬離子，而無金屬類Fenton體系是一種新興的替代降解技術。Li Junhui等[98]報道了一種超聲加速無金屬類Fenton降解法（US-H2O2/VC），該體系能在30 min內將果膠分子質量降低到7.9 kDa。由此可見，US可以作為一種輔助降解果膠的有效手段。

現有的降解方法仍存在一定的局限性，或降解能力有限，或反應條件苛刻，或對環境不友好。因此，尋找其他更加經濟高效、綠色環保的降解方法來制備POS是今后研究的重要方向。

2 POS的分離純化及結構鑒定

2.1 POS的分離純化

對果膠降解后得到的一系列POS產物進行分離純化，可為后續寡糖片段的結構鑒定和活性研究奠定基礎。常用于POS分離純化的方法，包括色譜法、膜分離法及二者的聯合法。

2.1.1 色譜法

色譜法具有選擇性好、分離效率高、操作簡便等優點，被廣泛應用于多糖類物質的分離純化過程。離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法是最常用的色譜分離技術[129-131]。李健軍等[132]利用強陰離子交換樹脂對半乳糖醛酸寡糖的分離分析方法進行了研究，得到了5 種單一DP的寡糖片段。葡聚糖凝膠（SepHadex）、瓊脂糖凝膠（SepHarose）和聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel P）是3 種常用的凝膠過濾色譜柱[23]。劉閃閃[7]通過離子交換層析柱Superdex30對果膠降解產物進行分離純化，采用高效排阻色譜法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）在線跟蹤檢視，合并相同組分，得到6 種單一峰的POS。Yu Li等[131]通過Sephadex G-25、Sephadex G-75和Sepharose CL-6B 3 個系列柱洗脫果膠降解產物，得到5 種純化的POS餾分。

2.1.2 膜分離法

膜分離法包括UF和納濾（nanofiltration，NF），具有過濾簡單、易控制等優點，也常被用于POS的分離純化。Zhu Rugang等[3]通過UF、NF膜分離技術對果膠降解產物進行分級，得到3 種分子質量范圍的POS。Prandi等[133]采用4 種UF/NF平板膜（MWCO分別為400、700、1 000、5 000 Da）對甜菜果膠的降解產物進行分級，得到5 種不同的寡糖片段。Iwasaki等[134]采用UF膜和NF膜從酶解果膠中分離出具有促進生菜根系生長活性的POS。

2.1.3 色譜法和膜分離法聯合

除了色譜法和膜分離法，也有研究聯合這兩種方法進行分離純化[135]，以獲得更高純度的POS。對系列POS混合物分離純化后，還需要對其純度進行鑒定。多糖純度分析是其精細結構和化學性質分析的前提。測定多糖純度的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法[23]、電泳法[136]、超濾離心法、凝膠過濾法等，其中電泳法和色譜法最為常用，若為均一或純的多糖，則在色譜柱上洗脫后表現為單一對稱峰[137-138]，電泳后為單一條帶。石慧敏等[139]利用離子色譜、質譜對得到的7 種寡聚半乳糖醛酸進行了純度、相對分子質量檢測，結果表明這些寡聚半乳糖醛酸分子純度均高于95%，DP為2～7，連接方式為α-(1→4)。高純度的POS分子可作為果膠結構解析的標準品，有利于進一步研究其生物活性，同時有待于進一步開發為功能性寡糖產品。

POS分離純化方法匯總如表9所示。

表9 POS的分離純化方法Table 9 Methods for isolation and purification of POS

續表9

2.2 POS的結構鑒定和形貌表征

POS具有復雜的結構特征，其生物活性與結構之間存在密切關系。因此，解析分離純化后POS的結構，進行實時、快速的定性定量分析，對今后POS生物活性機制的研究及功能性食品的開發具有指導意義。

2.2.1 結構鑒定

POS的結構鑒定方法有：分子質量測定[24]、單糖組成分析[27]、高碘酸氧化及Smith降解[137]、甲基化分析[138]、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）分析[86]、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析[128]、色譜分析[103]、質譜（mass spectrometry，MS）分析[141]、X射線衍射分析[126]和紫外光譜分析[142]等。

POS分子質量測定是根據分子相對大小進行分離測定，主要包括HPSEC[143]和高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法[141]。支梓鑒[24]利用HPSEC法檢測了降解后果膠的分子質量，并利用breeze2軟件測定其mw及分散系數。Cao Jing等[128]通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統對POS進行分離，采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatograph，GPC）法測定了MCP的分子質量。單糖組成分析常用的方法有PMP/AEC柱前衍生化-HPLC法[144]、高效陰離子色譜-脈沖安培檢測[128]（high performance anion exchange chromatographypulse amperometric detection，HPAEC-PAD）、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用[142]等。大量研究表明，果膠在降解前后，單糖組分未發生明顯變化，但各部分單糖含量變化較大。Cao Jing等[128]采用HPAEC法測定了純化的MCP的單糖組成，結果表明MCP4和MCP10均由7 種單糖組成，MCP10被認為是一個高度支化的RG-I富集結構，MCP4是一個高度線性化的HG富集結構。Yeung等[86]利用PMP柱前衍生反相高效液相色譜（reversed phase-HPLC，RP-HPLC）分析了POS的單糖組成，結果表明在POS中，隨著FeSO4濃度的增加，GalA含量顯著降低，Rha含量顯著增加，說明果膠的HG區域發生解聚；RG-I側鏈相關的中性糖Ara和Gal含量顯著降低，說明RG-I區域也發生了部分裂解。

高碘酸氧化-Smith降解和甲基化分析是確定植物多糖和寡糖糖苷鍵類型和位置的重要手段[145]。糖苷鍵的類型、位置及分支數等信息可通過測定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量來初步判斷，然后利用Smith降解進行酸水解，可進一步確定糖苷鍵的類型和位置[146]。甲基化分析通常結合GC-MS等手段來確定寡糖和多糖中單糖單位間糖苷鍵的位置，同時還可以得到不同連接方式的單糖殘基在多糖分子中的比例信息[147]。例如，Shakhmatov等[148]通過Smith降解石榴果膠（PGO）得到PGO-SD，通過凝膠過濾色譜對PGO-SD進行分餾，得到分子質量為17 kDa的PGO-SD1亞餾分，與初始多糖相比，PGO-SD1中性單糖殘基（Gal、Rha和Ara）含量較高，UA殘基含量較低。孫瑋璇[149]采用甲基化、核磁共振分析方法發現薯渣果膠RG-I結構域中1,4-半乳聚糖、1,5-阿拉伯聚糖通過Rha的O-2連接在RG-I主鏈，其中1,4-半乳聚糖中還具有1,3-半乳聚糖分支和末端Ara修飾。

另外，FTIR、NMR和MS法也常用于POS結構的解析。其中FTIR可以根據特征吸收峰，分析寡糖結構中的官能團等信息[86]。NMR包括1H-NMR、2D-NMR[128]（相關譜、總相關譜、異核單量子關系）和13C-NMR，可以提供寡糖的重要結構信息，如α-或β-異位構型、單糖組成和鍵合模式，能準確測定出結構表征基團的化學位移[23]和峰寬。Zhi Zijian等[22]針對1H-NMR譜分辨率較低的問題，采用2D-NMR通過分配化學位移進一步確定了降解餾分UFP2的化學結構。MS包括GC-MS[6]、電子電離質譜、電噴霧電離質譜[83]、電噴霧電離-碰撞誘導解離質譜（electrospray ionization-collision induced dissociation-MSn，ESI-CID-MSn）[141]等，具有檢測靈敏度和分辨率高、分析快速、所需樣品量小（只需pmol～nmol）等特點，在糖苷鍵連接方式、寡糖序列分析方面具有重要作用。例如，呂友晶[141]采用ESI-CID-MSn技術共鑒定出46 種POS寡糖序列。

2.2.2 顆粒形貌表征

為了更直觀地觀察果膠降解前后的變化，可進一步對POS的顆粒形貌進行表征，包括粒徑分析、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析和AFM分析等[126,150]。Chen Xiaowen等[35]發現山楂果膠經超聲處理10 min，其粒徑從1 465 nm降低到453.6 nm，SEM分析表明US處理的果膠呈片狀結構，表面出現一些絲狀結構和部分剝落。Hu Weiwei等[126]利用AFM對果膠降解前后的分子形狀進行了觀察，AFM圖像表明降解前的果膠鏈略有聚集，降解后聚合物結構消失，長鏈被裂解成短鏈。這些表面形貌變化的結果與其分子質量等測定結果一致，進一步證明了US-NaHCO3-H2O2是一種制備低分子質量果膠的有效方法。

3 POS的生物活性及構效關系

近年來，大量研究表明，果膠降解后得到的POS片段具有更強的生物活性[98,126]。它們的活性與其獨特的結構之間存在密切關系，如分子質量、單糖組成、DP、化學成分、精細結構等。

3.1 抗癌（抗腫瘤）活性

雖然化療在腫瘤和癌癥治療中是目前最有效的手段，但也存在一些缺點，如腫瘤細胞耐藥性、對健康細胞的嚴重副作用等，因而使用天然抗癌物質近年來備受關注。腫瘤特異性半乳糖凝集素-3（galectin-3）是一種β-半乳糖結合蛋白，是腫瘤細胞轉移的關鍵分子，通過與正常細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的β-半乳糖苷結合，從而將正常細胞轉化為癌細胞（圖3A）[151-152]。已有研究證實，POS可與galectin-3相互作用，降低體內galectin-3水平，從而抑制癌細胞的形成、轉化和轉移（圖3B）。

圖3 POS抑制癌細胞增殖的作用機理[23]Fig.3 Mechanism by which POS inhibits proliferation of cancer cells[23]

相比完整的天然果膠，POS由于分子質量較小、生物利用度較高而具有更好的galectin-3抑制作用。Kapoor等[23]從番茄果膠中分離的低聚糖（pectic-oligosaccharide isolated from sour raw tomato，SrTPO）比番茄完整果膠（SrTPP）對galectin-3的抑制效果強10.4 倍，并發現SrTPP僅附著在細胞表面或低攝入量，而SrTPO是一種小分子結構，可以通過其特異性的糖結合域與galectin-3更好地結合（圖3）。RG-I結構域富集的POS由于含有半乳糖醛酸側鏈而具有較強的生物活性[153-154]。Li Junhui等[98]的研究表明，相比天然果膠，低分子質量果膠多糖（low-molecular-weight pectin polysaccharide，LMP）3（7.65 kDa）對MCF-7細胞具有更強的抗腫瘤活性，這可能與其分子質量和降解過程提供了RG-I富集的具有高度分支的結構有關。然而，也有研究表明富含RG-II結構域的POS具有更強的生物活性[155-156]。Ai Lianzhong等[143]研究發現果膠片段RG-II對體外培養的人結腸癌細胞（Caco-2）的抗增殖作用優于RG-I，且呈濃度依賴性。另外，多糖的活性與硫酸基團含量也有很大關系，較高的硫酸基團含量使其具有較好的抗腫瘤活性。劉閃閃[7]研究結果表明，柑橘囊衣果膠經降解后，其體外抗腫瘤活性增強，且對降解產物POS1及POS2進行硫酸酯化后，其體外抗腫瘤活性進一步增強。

除細胞模型外，還有研究利用小鼠模型分析POS的體內抗癌作用。沈彥偉[157]利用4T1細胞系建立了Balb/c小鼠的乳腺癌自發腫瘤模型，并利用該摸型闡明了低分子柑橘果膠聯合氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）化療治療可抑制乳腺癌的腫瘤生長，延長乳腺癌荷瘤小鼠的生存時間；進一步信號通路分析顯示，低分子柑橘果膠是通過阻斷galectin-3分子，從而減少MDSC細胞在小鼠體內的積累。有些抗癌藥物不僅抑制癌細胞的生長，而且也會抑制正常細胞的生長，對正常細胞具有毒性；而低分子質量POS具有天然安全、無毒性，可選擇性地抑制癌細胞生長，它將成為一種潛在的腫瘤和癌癥協同治療方法。

表10總結了POS抗癌活性與其結構之間的關系。

表10 POS抗癌活性與其結構之間的關系Table 10 Relationship between anticancer activities of POS and their structures

續表10

3.2 抗氧化活性

過度活性氧或活性氮誘導的氧化應激反應會對細胞結構和生物分子功能造成嚴重破壞，引發多種疾病。過度產生活性氧及活性氮將被非酶抗氧化劑和抗氧化酶平衡[159]。近年來，研究表明天然果膠降解產物POS具有潛在的抗氧化活性，引起了人們的廣泛關注。

POS的低分子質量是果膠降解后抗氧化活性提高的主要影響因素（表11）。一般來說，多糖的相對分子質量越大，體積越大，越不利于其跨越多重細胞膜障礙進入生物體內發揮生物學活性。POS由于分子質量降低、表面積和水溶性增加，與自由基相互作用機率升高而具有更強的抗氧化活性[86,101]。Abari等[101]采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法測定了質量濃度相同的果膠和POS的抗氧化效果，結果表明，POS質量濃度為20 mg/mL時，其清除自由基的能力約為93%，超過相同質量濃度果膠的50%。然而，也有研究表明并非多糖的分子質量越低其活性就越強[160-161]，POS的抗氧化活性與其分子質量之間并不是簡單的線性關系，POS的抗氧化活性與其質量濃度也有關系[68]。因此，需要進一步研究POS片段的抗氧化活性與結構差異之間的關系。

表11 POS抗氧化活性與其結構之間的關系Table 11 Relationship between antioxidant activities of POS and their structures

續表11

3.3 抗炎活性

研究表明，POS的抗炎作用可能與多種分子機制有關，通過降低炎癥反應從而影響免疫系統，在免疫調節方面發揮不同的功能[154]。亞硝酸鹽（一氧化氮的穩定代謝物）含量的異常產生是RAW 264.7細胞炎癥出現的標志[86]。基于此，Yeung等[86]研究了3 種POS（POS3、POS5、POS7，mw分別為6.09、4.89、1.79 kDa）的抗炎活性，結果表明低分子質量的POS抑制了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的亞硝酸鹽和炎癥因子（包括白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6）以及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）/核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路在RAW264.7細胞中的表達，因為低分子質量的POS有更多的活性位點與自由基相互作用，從而阻止促炎細胞因子的合成。NF-κB的激活可誘導編碼促炎細胞因子（如IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α））的基因表達上調[162]，羅司丹[127]以LPS刺激的THP-1細胞作為炎癥模型研究了MCP（MCP12-P和MCP4-P）的抗炎作用，結果顯示MCP12-P和MCP4-P均可顯著抑制IL-1β和TNF-α細胞因子的分泌，抑制率分別達到29%～34%和24%～42%，且兩種MCP還可以抑制NF-κB蛋白表達，抑制率為25%～35%，這可能與其GalA殘基的減少和RG-I片段的保留有關。由于結腸炎與結腸癌的發生高度相關，而NF-κB在LPS將結腸炎轉化為結腸癌的過程中具有重要作用[128]，因此，推斷POS可通過抑制炎癥來抑制結腸癌。

3.4 益生元活性

益生元是一種非消化的食物成分，通過選擇性地促進益生菌（主要是雙歧桿菌和乳酸菌屬）的生長和產生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）從而降低有害細菌的致病作用，進而有益于宿主[86]。近年來，低聚木糖、低聚半乳糖和異麥芽糖等多種非消化低毒低聚糖逐漸進入市場。同時，果膠也被認為是具有益生元潛力的低聚糖來源，在食品和制藥行業有著很高的需求[163-167]。在使用前，果膠必須被水解成短鏈的POS，以更好地提高益生菌的生長性能。Wongkaew等[168]利用酶解處理芒果果膠獲得分子質量為643 Da的寡糖，此時B.animalisTISTR 2195和L.reuteriDSM 17938的益生元活性得分最高。Zhu Rugang等[3]發現POS的體外抗糖基化活性和益生元活性與其分支度（Ara與Rha物質的量比和Gal與Rha物質的量比）有關，而酯化程度對抗糖基化和益生元活性的影響較小。同樣，Singh等[167]也報道稱POS可被視為有效的益生元，用于維持人體腸道內的免疫和微生物穩態，并發現POS的DP和結構決定了其生物學活性，POS的酯化程度不是關鍵影響因素。目前，雖然初步研究已經獲得了具有良好益生元效應的POS（表12），但仍不清楚它們在人體研究中是否會具有類似的效果。因此，雙歧桿菌和乳酸菌利用POS的機制有待進一步研究。

表12 POS益生元活性與其結構之間的關系Table 12 The relationship between prebiotic potential of POS and their structures

3.5 抗菌活性

另有研究報道，POS還具有良好的抑菌活性。孫靜[136]利用濾紙片法測定了果膠及其降解產物的抑菌活性，結果表明果膠及其降解產物中，只有寡聚半乳糖醛酸可以抑制大腸桿菌（E.coli）及金黃色葡萄球菌（S.aureus）的增殖。Li Peijun等[161]采用S.aureus、B.subtilis和E.coli對3 種POS進行抑菌活性檢測，結果表明，3 種POS對細菌有較強的抑制作用，對真菌無抑制作用，且POS1、POS2（對S.aureus、B.subtilis、E.coli的MIC分別為12.5、12.5、25.0 mg/mL）的抑菌活性高于POS3（對S.aureus、B.subtilis、E.coli的MIC分別為25、25、50 mg/mL）；在該研究中低分子質量低聚物比高分子質量低聚物具有更高的抗菌活性，這可能與游離的未解離的羧基、甲氧基及其DP有關。同樣，王巍[170]研究了不同DP的山楂POS（DP 2～5）作用于5 種供試菌的抑菌性，結果顯示DP為3的山楂POS抑菌效果最顯著，其中對S.aureus、E.coli和B.subtilis有很好的抑菌效果，MIC分別為0.625、1.250、0.625 g/L，抑菌圈大小分別為16.5、15.0、20.5 mm。微生物污染是食品腐敗變質的一個重要原因，而POS作為一種潛在的天然、經濟又安全的抑菌物質，可將其應用于食品加工、貯藏、保鮮與食品材料的開發應用中。

3.6 其他活性

除上述生物活性外，POS還具有許多與人類健康密切相關的生理活性，如降膽固醇、降血脂、改善肥胖、免疫功能、腸道菌群調節、吸附重金屬離子等。張若培等[171]探討了低分子質量柑桔果膠對肥胖大鼠體質量、血脂和瘦素水平等的影響，發現MCP具有改善大鼠肥胖及降低高血脂水平的作用。Eliaz等[172]評估了改良的低分子質量MCP對健康個體尿液中有毒元素排泄的影響，研究表明口服MCP可顯著增加具有“正常”金屬體負荷的受試者對有毒金屬的尿液排泄。MCP對有毒重金屬的螯合作用可能部分歸因于其蛋殼結構（RG-II）的存在[173]。低分子質量果膠還具有更強的免疫調節功能，能增強人體免疫，可用于制備增強免疫功能的食品、藥品和保健品等[174]。

綜上所述，降解反應能夠提高果膠的生物活性，這可能是由于降解反應使得果膠鏈斷裂，分子質量降低，一方面接觸面積增加，親水基團更多暴露在溶液中更容易發生降解反應；另一方面，隨著分子質量的降低，溶解性增加，生物可利用度也隨之增加，活性基團暴露增多。值得注意的是，POS的生物活性與其分子質量、DP、單糖組成及精細結構等特征密切相關。然而，即使有如此多關于POS生物活性與其結構之間關系的研究，還是很難將一個獨特的分子結構與特定的某種與健康相關的生物活性聯系起來。

4 結 語

本文綜述了POS的制備、分離純化、結構解析方法、生物活性及其構效關系等方面的內容。POS可以通過物理法、化學法、酶法和聯合法降解制備。目前研究中對于POS的制備多以聯合法降解為主，但這些方法仍存在一定的局限性，或降解能力有限、或反應條件苛刻、或污染環境、或影響降解產物的活性，需要尋找其他更加經濟高效、綠色新穎的降解方法。而O3氧化降解具有高效、綠色、原料來源充足等優點，有望成為一種制備POS的新方法。POS也因獨特的結構和生物活性越來越受到研究者們的關注，大量國內外研究表明POS具有抗腫瘤、抗癌、抗氧化、抗炎、益生元、抑菌、免疫調節、降血脂和吸附重金屬離子等多種活性。本文對POS的構效關系進行了初步探討，為了更好地理解POS的作用機理，還需要更進一步研究其精細結構與生物活性之間的關系，從而為POS的應用提供理論指導。此外，目前對POS生物活性開展了大量體外細胞實驗研究，未來可將其延伸至動物水平或具體食品基質中探究其活性，以及POS在人體胃腸道內的代謝情況，以期開發出富含POS的新型功能性食品，并有利于POS在食品、農業和醫學等領域發揮其重要作用。