雙歧桿菌及其制劑對炎癥性腸病作用機制研究進展

楊 碩，唐宗馨，段勃帆，陳禹含，郭歡新，孟祥晨*

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性復發性炎癥性疾病，包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）[1]。免疫失衡、腸道屏障通透性的改變、微生物群的狀態以及飲食與生活方式等環境因素的變化都對該病的發生和發展有很大影響[2]。Jacob等[3]于2020年對IBD發病率進行統計分析發現，每年歐洲UC的患病率為24.3～505.0/10萬 人，而CD的患病率為12.7～322.0/10萬 人；北美UC的患病率為19.2～249/10萬 人，而CD的患病率為20.2～319/10萬 人。近年來隨著城市化進程不斷發展，中國IBD的發病率也逐漸上升，到2025年預計將有150多萬IBD病例[4]。目前，IBD的治療方法聚焦在應用抗炎藥物方面，如糖皮質激素、5-氨基水楊酸、硫嘌呤生物制劑等可用于不同類型的IBD治療[5]。隨著對腸道菌群研究的深入，益生菌治療也成為研究熱點，雙歧桿菌作為腸道內的優勢有益菌群，菌體自身或其代謝產物可黏附于腸道，阻止致病菌的定植以及易位[6]。本實驗室前期研究表明，將兩歧雙歧桿菌H3-R2作用于免疫低下小鼠中可修復腸道黏膜，調節炎癥因子，同樣證明雙歧桿菌具有替代治療或者輔助治療IBD的潛力[7]。本文綜述了雙歧桿菌及其制劑在IBD治療中的應用及其作用機制。

1 雙歧桿菌及其制劑概述

腸道菌群具有轉化食物、調節免疫功能、影響脂肪儲存等重要功能[8-10]。雙歧桿菌屬作為腸道菌群的主要組成部分，其代謝過程中產生的共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）、胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）以及吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）等多種物質均已被證明具有調節腸道穩態及其他多種生理功能[11-14]。同時，雙歧桿菌也因其可增強免疫、抵制有害菌侵入等多種益生功能而在工業上被廣泛生產制備為緩解腸道疾病制劑。常見的有雙歧桿菌三聯活菌片、雙歧桿菌四聯活菌片、常樂康以及金雙歧等制劑[15]。

市售雙歧桿菌制劑種類有限并且多為復合益生菌制劑，單菌制劑較少，除受雙歧桿菌自身嚴格的生長條件影響外，還因有研究表明，治療UC時應用混合益生菌的療效優于使用單菌株療效[16]。Wang Nana[17]、Fujiwara[18]、Philippe[19]等的實驗均證明動物雙歧桿菌、長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌17具有緩解結腸炎效果。但Yu Rui等[20]將青春雙歧桿菌IF1-03以及青春雙歧桿菌IF1-11分別作用于葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的IBD模型小鼠，發現IF1-03對DSS誘導的結腸炎具有保護作用，而IF1-11卻幾乎沒有改善作用。同時，Fleming等[21]發現短雙歧桿菌BBG-001對于恢復腸道屏障、調節腸炎無明顯效果。以上結果表明，不同種乃至不同株的雙歧桿菌益生效果具有菌株特異性，針對不同菌株的作用效果仍需繼續進行探索。

2 雙歧桿菌及其制劑在IBD中的應用

UC和CD的發病原因、病理特征和病變范圍不完全相同，UC病變主要集中在結腸，以黏膜炎癥為特征，而CD的病變范圍涉及到整個胃腸道，以透壁炎癥為特征[22]。研究發現將益生菌應用于UC治療比應用于CD治療更有效[15]。同樣地，雙歧桿菌及其制劑在IBD中的應用也更多集中于UC的治療。

雙歧桿菌及其制劑廣泛應用于UC的治療，Amiriani等[23]采用隨機、雙盲臨床試驗方法將60 名輕中度UC患者分為兩組，隨機給予包含雙歧桿菌的復合益生菌制劑或安慰劑進行為期8 周的治療，結果顯示益生菌組臨床結腸炎活動指數（simple clinical colitis activity index，SCCAI）顯著降低，并且益生菌組的治療效果在超過5 年病齡的患者中更加顯著。另外，針對日本輕度至中度活動期UC患者的實驗結果表明，長雙歧桿菌536不僅在腸道中具有良好的耐受性，而且用其治療8 周后顯著降低了患者疾病活動指數（disease activity index，DAI）和結腸Rachmilewitz內鏡指數（endoscopic index，EI）[24]。除此之外，雙歧桿菌與治療UC的藥物聯合還具有協同作用，di Pierro等[25]研究表明長雙歧桿菌W11可作為抗生素治療的輔助劑，比單獨使用利福昔明治療效果增加了一倍。Palumbo等[26]研究表明，與單獨接受美沙拉嗪治療相比，接受美沙拉嗪聯合含有雙歧桿菌的復合益生菌治療的UC患者病情得到更好的改善；而且益生菌的聯合治療效果甚至在治療兩年之后也依舊明顯。

由于CD發病機制相對復雜、并發癥多，雙歧桿菌及其制劑在治療CD方面的研究相對有限[27]。Fedorak等[28]評估了益生菌合劑VSL#3（8 種不同的益生菌種類的混合物，包含3 株雙歧桿菌）預防CD術后復發的效果，結果發現與術后90 d后再進行益生菌晚期干預治療相比，在行腸切除術后立即接受并持續接受一年的VSL#3治療可顯著降低白細胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β等促炎細胞因子的水平，同時顯著降低術后復發率。Steed等[29]應用長雙歧桿菌和Synergy1組成的合生元對35 名活動性CD患者進行為期6 個月的治療，發現合生元顯著降低了黏膜組織中的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平，并促進了雙歧桿菌對腸道黏膜表面的定植。最終，接受合生元治療患者的臨床癥狀得到顯著改善，DAI有所降低。然而，也有研究表明將動物雙歧桿菌作用于從CD患者分離衍生出的巨噬細胞無明顯有益作用[30]。由于益生菌應用于CD治療的研究較少，雙歧桿菌及其制劑在CD治療中的應用仍需進一步驗證。

3 雙歧桿菌及其制劑對IBD作用機制

3.1 調節免疫系統

雙歧桿菌及其制劑可以通過其菌體成分或代謝產物等作用于炎癥信號通路（圖1），調節炎癥因子等物質的產生，從而調節免疫系統，起到抗炎作用。

圖1 雙歧桿菌及其制劑調節IBD的經典信號通路Fig.1 Classic signaling pathways for IBD regulation by Bifidobacterium and its preparations

首先，無論是菌體成分還是其代謝產物均需結合細胞膜受體發揮作用，經雙歧桿菌代謝產生的乙酸等SCFAs結合GPCRs，從而刺激下游炎癥信號通路發揮抗炎作用[31]。TLRs是主要的結合通路，TLRs作為模式識別受體可感知和識別病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如未甲基化的雙鏈DNA、單鏈RNA、肽聚糖、脂蛋白等，從而激活下游信號，需注意TLR2必須與TLR1或TLR6形成異二聚體才能傳輸信號[32]。信號傳輸下游炎癥信號通路主要有3 條：1）NF-κB通路：重要下游炎癥信號通路，經刺激后，IκB泛素化降解，使P50/P65二聚體進入細胞核誘導靶基因轉錄[33]；2）JAK-STAT通路：經膜受體識別，隨著JAK的激活，使STAT磷酸化，而后形成磷酸化STAT二聚體入核，誘導靶基因轉錄調控炎癥[34]；3）MAPK通路：MAPK家族主要有3 類——JNK、ERK和p38 MAPK，通過3 條級聯反應方式進入細胞核內，形成AP-1、TCF、ATF2等轉錄因子，調控炎癥因子表達[35]。大量研究表明，雙歧桿菌及其制劑可以作用于以上通路的關鍵蛋白，進而調節IBD，表1列出了雙歧桿菌作用以上炎癥信號通路及作用效果的相關研究。

表1 雙歧桿菌調節IBD的經典信號通路Table 1 Classical signaling pathways for IBD regulation by Bifidobacterium

3.2 調節氧化應激反應

近年來的研究表明氧化應激在IBD的致病機理中起關鍵作用，生理條件下氧代謝可產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），在機體健康情況下，一定含量的ROS對于維持正常的腸道穩態有益，但當腸道發生炎癥時會產生ROS，腸道通透性會隨著ROS積累量的增加而增高，可導致腸道細菌通過腸壁轉位增加，加速炎癥反應[48]。另外，IBD以廣泛聚集中性粒細胞為特征，髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）作為中性粒細胞原代顆粒的標志，通過過氧化物酶循環等途徑能有效地生成ROS[49]。研究表明服用含有雙歧桿菌的復合益生菌可以顯著降低MPO含量，降低腸道炎癥小鼠的組織病理學評分[50]。

Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是組織和細胞中最重要的抗氧化防御系統之一，可調控抗氧化酶的基因和蛋白表達，正常狀態下胞質中的Nrf2泛素化后被降解，而在受到刺激后胞質中的Nrf2從與Keap1結合的復合物中解離下來進入核內，與抗氧化反應元件（antioxidant responsive element，ARE）結合進行谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等的轉錄[51]（圖2），這些抗氧化蛋白表達量在IBD患者中均有所降低。Wang Yuanyuan等[52]用植物乳桿菌ZDY2013與兩歧雙歧桿菌WBIN03的單菌懸液及混合菌懸液灌胃經三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）誘導的IBD小鼠，結果表明益生菌治療組通過激活Nrf2通路，使血清中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、CAT和SOD活性提高，結腸組織中抗氧化酶相關因子SOD1、GPX2、CAT相對表達量增加，從而通過抗氧化途徑使小鼠結腸炎癥有所緩解。

圖2 不同狀態下的Keap1/Nrf2通路Fig.2 Keap1/Nrf2 pathway in different states

雙歧桿菌的代謝產物也可通過調節氧化應激反應緩解IBD，長雙歧桿菌CCFM752上清液可以增強A7R5細胞內CAT活性，降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性，從而表現出抗氧化的特性[53]。嬰兒雙歧桿菌代謝產生的吲哚乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）可以與芳香烴受體（aryl hydrogen receptor，AhR）結合刺激Nrf2通路，增加靶基因GPX2、SOD2和NAD(P)H脫氫酶的mRNA表達，通過調控氧化應激反應保護腸道細胞[54]。齒雙歧桿菌可以分泌γ-谷氨酰半胱氨酸，該半胱氨酸可轉化為抗氧化劑并抑制氧化應激。含有γ-谷氨酰半胱氨酸的細菌分泌產物以及純化的γ-谷氨酰半胱氨酸進入細胞并上調GSH水平，從而抑制內質網應激介導的ROS，并使內質網應激表型最小化，調節未折疊蛋白反應，從而使黏液蛋白的表達量增多，調節IBD反應[55]。

3.3 恢復腸黏膜屏障

腸道黏膜屏障是宿主抵御致病菌和感染的第一道防線，在IBD愈合以及恢復過程中維持腸道黏膜屏障完整性以及免疫穩態至關重要[56]。腸黏膜屏障由微生物屏障、機械屏障、化學屏障、免疫屏障4 個部分組成[57]，這4 個部分在腸道內共同作用（圖3）。

圖3 腸黏膜屏障Fig.3 Intestinal mucosal barrier

微生物屏障是指寄生在腸道的微生物與宿主形成的復雜腸道生態系統，自出生開始，宿主腸道微生物逐漸具備復雜的消化和代謝功能，形成多樣的以及穩定的常駐菌群，該菌群通過彼此間共生、拮抗、與致病菌競爭結合位點以及直接或間接參與抗菌物質的合成，進而展現出抗炎和免疫調節的作用，對腸道內維持穩態環境至關重要[58]。研究表明，IBD患者腸道菌群穩態失衡，與健康受試者相比，雙歧桿菌屬、真桿菌屬和柔嫩梭菌屬等腸道有益菌屬含量顯著降低，而擬桿菌屬等潛在致病菌屬含量顯著增加[59]。研究表明，改善腸道微生物組成已成為治療IBD的重要輔助手段[49]。Yang Bo等[60]利用短雙歧桿菌CCFM683灌胃DSS誘導的IBD模型鼠后對其糞便菌群進行分析，發現在科水平上雙歧桿菌可以抑制DSS導致的紫單胞菌科和脫硫弧菌科相對豐度增加，同時增加消化鏈球菌科的豐度，進而恢復腸道菌群平衡。同樣地，馬巖等[61]給DSS誘導的IBD模型小鼠灌胃動物雙歧桿菌乳亞種XLTG11后對結腸內容物進行分析。結果表明，在門水平上，雙歧桿菌組抑制了DSS導致的變形菌門豐度升高，且增加了厚壁菌門和放線菌門的豐度。在屬水平上，雙歧桿菌組增加了雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬等有益菌屬的豐度，降低了幽門螺旋桿菌屬等潛在治病菌屬的豐度。

化學屏障包括腸腔內水分、消化液以及腸黏液層，其中起重要保護作用的為腸黏液層，它位于腸黏膜屏障的最外層，可以起到保護腸黏膜不受有害微生物破壞及酸堿侵蝕的作用，從而為上皮細胞提供一個完整的防御，以抵御有害物質和病原體，它是宿主與腸道內環境接觸的第一道屏障[62]。Kiu等[63]將短雙歧桿菌UCC2003灌胃小鼠2 周后，對小鼠腸上皮細胞的轉錄組進行分析發現，編碼黏蛋白的編碼基因Muc2、Muc6、Muc5b和Muc4表達量均顯著上調，證明了雙歧桿菌對化學屏障的保護作用。同時，Caballero-Franco等[64]研究發現，Wistar大鼠口服補充VSL#3對黏液結構有影響，并刺激Muc2基因的表達，但對Muc1和Muc3表達量的影響很小；另外，非黏液糖蛋白的分泌量也增加，這導致腸道黏液含量增加了60%，提高了腸道屏障的通透性，從而起到保護腸道的作用。

機械屏障主要由腸上皮細胞與相鄰細胞間的連接構成完整的腸上皮結構，其連接方式包括緊密連接、縫隙連接、黏附連接及橋粒連接等，而圍繞在上皮頂側的緊密連接則是維持腸黏膜機械屏障的結構基礎，是機械屏障最重要的結構[65]。短雙歧桿菌UCC2003灌胃后的小鼠與空白對照組小鼠相比，其轉錄組中與機械屏障功能相關的關鍵基因表達量顯著上調，其中包括編碼閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）蛋白的Tjp1基因[63]。Chen Xiaohong等[66]給TNBS誘導的IBD模型鼠灌胃長雙歧桿菌HB5502后發現，小鼠結腸中緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白（Occludin）-1和密封蛋白（Claudin）-1的表達量顯著升高。Ling Xiang等[67]的實驗同樣證明，雙歧桿菌作用于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的炎癥細胞可上調Occludin、Claudin-3和ZO-1這些緊密連接蛋白的表達。

免疫屏障主要由腸相關淋巴組織（gut-associated lymphatic tissue，GALT）和分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，SIgA）以及相應的免疫反應構成，腸道免疫屏障是腸道免疫穩態的重要保障[68]。Shang Jiacui等[7]將兩歧雙歧桿菌H3-R2作用于免疫低下小鼠，實驗結果表明此菌株可以促進強SIgA的產生，促進免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖，具有免疫調節作用。同時，Treg在免疫反應中起關鍵作用，Zhou Linyan等[69]將嬰兒雙歧桿菌作用于DSS誘導的IBD小鼠后，小鼠結腸組織中叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）表達量升高，另外細胞因子IL-10和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）表達量也升高，Foxp3表達量隨菌液濃度的增高而呈現明顯升高趨勢，由于Foxp3是控制Treg發育和功能的關鍵轉錄因子之一，因此證明此嬰兒雙歧桿菌可通過促進Treg細胞的增殖參與腸道內的免疫調節而在IBD的治療中發揮作用。

4 結 語

雙歧桿菌作為腸道重要的有益微生物之一，已用于IBD的治療，主要通過調節免疫反應、抗氧化應激以及保護腸黏膜屏障作用3 種不同機制發揮功效。通過以上綜述發現，該方面研究存在以下特點：首先，在UC以及CD治療中，因二者發病機制不一致，雙歧桿菌的治療效果也不相同；其次，目前雙歧桿菌作用于腸道炎癥的研究多為短療程；最后，單株或混合菌株的治療效果有顯著差異，雙歧桿菌的不同種甚至是亞種都有不同的作用機制。因此，繼續深入探索雙歧桿菌不同菌株在UC以及CD發生發展中的作用，需要注意其作為長期治療手段的安全性，同時目前研究大多集中于菌體直接作用，深入挖掘起作用的菌體成分及代謝產物能否靶向抑制炎癥信號通路的關鍵蛋白對今后的臨床治療意義重大。