斑馬魚wbp11基因敲除品系的建立游詩琦 陳宇 楊雪婷 李韻璇 喬卿 羅瑩

姚梅英 高羅晴 劉欣 王躍群 吳秀山 李永青

摘 要：WBP11是WW結構域結合蛋白家族的一員，參與前體mRNA剪接過程，是重要的剪接因子。斑馬魚作為重要的模式生物之一，其基因組中含有人類WBP11的同源基因wbp11。為了研究WBP11在脊椎動物早期發育過程中的作用機制，利用CRISPR/Cas9技術構建了斑馬魚wbp11基因敲除品系。首先，在wbp11基因的第二個外顯子上設計基因敲除靶位點，體外轉錄合成sgRNA，通過顯微注射技術對斑馬魚進行基因敲除，得到F0代嵌合體斑馬魚。隨后，將嵌合體斑馬魚與野生型斑馬魚雜交，所得到的F1代斑馬魚進行基因型鑒定，篩選出其中的雜合子斑馬魚，并對雜合子斑馬魚的缺失條帶進行測序，結果顯示其為wbp11基因的2種缺失突變。讓同種突變的F1代雜合子斑馬魚自交，對得到的后代F2進行基因型鑒定，篩選獲得了純合子斑馬魚，表明wbp11基因敲除品系構建成功。經顯微鏡白光成像觀察發現，受精后48 h的斑馬魚出現心包水腫、心臟線性化、骨骼彎曲畸形，這可能是由于wbp11基因突變引起剪接機制異常所導致的。此研究為探究WBP11基因在脊椎動物的早期發育中的作用機制開辟了道路。

關鍵詞：斑馬魚；wbp11；CRISPR/Cas9；基因敲除；雜合子

中圖分類號：Q341；Q812 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.004

Construction of Zebrafish wbp11 Gene Knockout Line

YOU Shiqi1， CHEN Yu2， 3， YANG Xueting1， LI Yunxuan1， QIAO Qing1， LUO Ying1，

YAO Meiying1， GAO Luoqing1， LIU Xin1， WANG Yuequn1， WU Xiushan1， 3， LI Yongqing1?

（1. The Center for Heart Development， State Key Laboratory of Freshwater Fish Development Biology， Hunan Normal University， Changsha 410081， China; 2. Guangdong Cardiovascular Institute， Guangdong Provincial Peoples Hospital， Guangdong Academy of Medical Sciences， Guangzhou 510100， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis， Targeted Prevention and Treatment of Heart Disease， Guangzhou 510100， China）

Abstract： As a member of the WW domain binding protein family， WBP11 is an important splicing factor involved in the pre-mRNA splicing process. Zebrafish， one of the notable model organisms， contains orthological homologous gene wbp11 in its genome. In order to study the mechanism of WBP11 in the early development in vertebrates， a knockout strain of wbp11 in zebrafish was constructed using CRISPR/Cas9 technology. Firstly， gene knockout target sites were designed on the second exon of wbp11 gene， and sgRNA was synthesized by transcription in vitro. After microinjection technology， F0 generation chimeric zebrafish with wbp11-knockout was obtained. Then， the F1 generation zebrafish by crossing chimeric zebrafish with wild-type zebrafish were identified by genotype， and heterozygous zebrafish were screened out. The sequencing results for exact bands of heterozygous zebrafish showed that there were two strains with different sequence deletion. Heterozygous zebrafish of the F1 generation of the same strain were self-crossed. The homozygous zebrafish was screened out via genotyping， meaning the wbp11 gene knockout strain was successfully constructed. The zebrafish with 48 hours post fertilization showed pericardial edema， heart linearization and skeletal curvature obversed by microscopic white light imaging. These defections may be resulted from the abnormal splicing mechanism caused by the deletion of wbp11 gene. This study opens the way to explore the mechanism of WBP11 gene in the early development in vertebrates.

Key words： zebrafish; wbp11; CRISPR/Cas9; gene knockout; heterozygote

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 217-225）

WW結構域又被稱為Rsp5或 WWP domain，是由30～40個氨基酸所組成的結構緊密的三股反平行β折板結構域［1］。WW結構域具有特異專一性，能夠與富含脯氨酸序列（XPPXY）的蛋白質分子（P：脯氨酸，Y：酪氨酸，X：任意氨基酸）作用，廣泛存在于真核生物中，在蛋白質降解、轉錄和RNA剪接等多種細胞功能的調控中發揮重要作用［2］。而WW結構域結合蛋白家族，顧名思義，它們識別并結合含有WW結構域的蛋白質。其家族成員WW結構域結合蛋白11（WW domain binding protein 11，WBP11），參與前體mRNA剪接過程［3］。真核生物mRNA成熟前需要在細胞核中經過前體mRNA的剪接加工過程，即前體mRNA在剪接復合體的作用下，通過精確識別移除內含子并把外顯子進行拼接而得到成熟的mRNA，成熟mRNA再轉運出細胞核在核糖體被翻譯成蛋白質［4］。基因的剪接是重要的轉錄后調控，對于基因的差異表達、組織器官的發育調控以及正常功能的維持具有重要的生理意義［5-7］。WBP11與 E3泛素連接酶PRP19（pre-mRNA processing factor 19）剪接體復合物相關，并共定位于富含剪接因子的核斑點［8-10］。該復合物是一種動態剪接核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復合物，負責去除非編碼片段、外顯子連接（編碼片段）和調節前體mRNA的可變剪接［11-13］。

目前對于WBP11基因的功能研究非常少。已有研究顯示，在人類和小鼠中，WBP11基因突變會導致人類出現多種先天性異常，包括先天性心臟病、椎體異常、食道異常、腎臟異常等，該基因突變的小鼠也表現出類似的先天性異常，但未發現有心臟畸形［14］。對于WBP11基因在其中的作用機制還未有研究，也不清楚WBP11突變體在心臟發育中的不同表現是由于物種差異還是其他原因所致。而作為重要模式生物的斑馬魚wbp11基因是人類和小鼠WBP11基因的直系同源基因，因此，我們首次使用CRISPR/Cas9技術對斑馬魚的wbp11基因進行特異性敲除，以獲得wbp11基因缺陷的突變體斑馬魚，從而為進一步探究wbp11基因突變對斑馬魚早期的生長發育所造成的影響以及其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的AB品系野生型斑馬魚（Barchydanio rerio var）由本實驗室繁殖飼養，水溫約28.5℃，采取14 h光照/10 h黑暗光周期，pH值維持在6.8～7.5。斑馬魚胚胎置于E3 Buffer，在28.5℃恒溫培養箱中孵育，4～6 d開始喂食草履蟲（Paramoecium caudatum），12 d開始草履蟲和豐年蝦（Artemia salina）混合喂養，15 d轉移到養殖系統中，直至3個月性成熟，成魚早中晚各喂食1次。

研究所用儀器與試劑：多聚酶鏈式反應儀，移液器和分光光度計（Eppendorf公司）；斑馬魚養殖系統（北京愛生科技發展有限公司）；離心機（Fresco生物）；凝膠成像分析系統（Tanon公司）；恒溫培養搖床（HZQ-A）（江蘇太倉儀器設備）；表型分析多倍顯微鏡（奧林巴斯公司）；倒置熒光體視鏡（蔡司公司）；拉針儀（narishige）；pH計（320-S）（Barnstead）；顯微注射儀（PLI-100A）（Harvard Apparatus）；精度分析天平（舜宇恒平）；DEPC水（0.1% DEPC溶于去離子水中）；E3 Buffer（5 mol/L NaCl溶液60 mL，1 mol/L KCl溶液10 mL，1 mol/L MgSO4 20 mL，CaCl2 2.94 g，甲基藍精粉1.00 g，去離子水定容至600 mL）；LB培養基（luria-bertani medium，肉湯培養基）（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，固體培養基則再加15 g瓊脂，去離子水定容至1 L）；2.0%瓊脂糖膠（2 g瓊脂糖，100 mL去離子水）；TrueCut? Cas9 蛋白（Thermo Fisher）；T7轉錄試劑盒（Promega公司）；pMD?18-T Vector Cloning Kit（寶生生物公司）；RNA提取試劑盒（迅捷生物公司）；逆轉錄試劑盒（蘭博利德公司）；純化試劑盒（OMEGA公司）。

1.2 設計sgRNA靶位點

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到斑馬魚wbp11基因組序列（Gene ID： 402950），并通過Ensembl數據庫對wbp11基因組進行分析，選擇靶位點。靶位點引物序列與T7啟動子序列以及guide RNA（gRNA）骨架連接，以帶有gRNA骨架的p42250酶切后的產物為模板，擴增wbp11 sgRNA。用primer 5.0軟件根據sgRNA的位置設計鑒定引物和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物。本試驗涉及的引物序列見表1。

1.3 靶位點sgRNA的PCR擴增與回收

p42250質粒經Bsa I酶切線性化后純化作為擴增模板，構建50 μL的PCR體系（其中2×buffer 25 μL，sgRNA-F/sgRNA-R均2 μL，線性化的p42250模板2 μL，dNTP各1 μL，ddH2O補齊至50 μL）進行擴增，依照Rapid Taq Master Mix設置常規PCR程序，退火溫度為60℃，延伸時間為15 s，設置30～35個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用純化試劑盒回收。

1.4 sgRNA的轉錄合成與純化回收

純化后的sgRNA產物利用T7轉錄試劑盒進行體外轉錄，全程注意RNA-free操作，取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳（200 V）快速檢測，確認轉錄成功后進行RNA純化，并測定其濃度。

1.5 顯微注射

注射的前天晚上，喂食10 min后將雌魚和雄魚按1：1或2：1的比例放入雜交缸中，用擋板隔開，10 h暗處理后，光照20 min，抽出擋板并給予強光刺激，在產卵后10 min后開始收集1細胞時期的胚胎，并排列在注射皿上注射sgRNA和Cas9蛋白的混合樣品（注射配比體系分別為100 ng/μL、250 ng/μL），之后將胚胎置于E3 Buffer中，28.5℃恒溫培養，每天換水2次并及時處理死胚胎，以免滋生霉菌。

1.6 斑馬魚基因組提取與鑒定

3個月性成熟后，分別剪取未注射的野生型（wild-type，WT）斑馬魚和注射魚成魚的尾鰭，使用堿裂解法提取斑馬魚基因組，魚尾鰭置于1.5 mL EP管中，加入90 μL濃度為50 mmol/L NaOH，沸水浴10 min，振蕩離心；加入10 μL（1/10 NaOH）pH=8.0的Tris-HCl，1 200 r/min離心5 min；吸取上清作為PCR模板，進行PCR擴增鑒定。

1.7 TA克隆

將純化后的目的PCR產物與pMD18-T連接，在1.5 mL的EP管中營造反應體系（其中pMD18-T Vector 1 μL，模板1～3 μL，Solution Ⅰ 5 μL，ddH2O補齊至10 μL），16℃處理2 h或4℃過夜，轉化涂布LB氨芐固體培養基平板并在37℃培養12～16 h。

1.8 qRT-PCR

利用試劑盒提取受精后48 h（48 hours post fertilization，48 hpf）斑馬魚的總RNA，隨后將其逆轉錄為cDNA。按照說明書提供的體系與程序進行qRT-PCR檢測，選取gapdh作為內參基因，將wbp11基因的mRNA表達水平進行標準化，再利用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析。

1.9 顯微鏡觀察

分別收集48 hpf的WT和顯微注射的斑馬魚幼魚，使用一次性吸管轉移幼魚至載玻片，在蔡司倒置熒光顯微鏡下觀察，可用注射器針頭撥動使幼魚側邊身體向上，拍攝記錄斑馬魚的機體發育情況。

2 結果分析

2.1 wbp11基因敲除靶位點的確定

首先，根據在NCBI和Ensembl網站的信息分析發現，wbp11基因包含9個外顯子，第一個外顯子序列太短，無法設計基因敲除靶位點，因此選擇位于wbp11基因編碼序列的第二個外顯子設計敲除靶位點。其上游引物命名為sgRNA-F，下游引物命名為sgRNA-R，靶位點長20 bp（圖1）。

2.2 wbp11基因敲除sgRNA的合成

以純化的線性化p42250質粒片段為PCR模板擴增目的片段，純化PCR產物后進行RNA體外轉錄，純化后的sgRNA片段為100 bp左右，與預期相符（圖2）。

2.3 wbp11基因敲除有效性鑒定及F0代突變等位基因嵌合體成年斑馬魚的篩選

本試驗設計的敲除靶位點為20 bp，鑒定引物在野生型斑馬魚中擴增出的目的片段大小為378 bp，理論上敲除后的目的條帶在358 bp左右，但由于CRISPR/Cas9產生的靶位點切口會觸發斑馬魚體內的修復機制來進行修復，并且這種修復是隨機的、不確定的，因此小于378 bp的條帶都是陽性結果。電泳結果如圖3所示：泳道1、3只有378 bp單一條帶，為野生型；泳道2、4除了目的條帶，還出現了比目的條帶小且較近的亮度微弱的條帶，說明敲除是有效的。

將F0代胚胎培養至3個月性成熟后，進行鑒定。部分瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖4所示：泳道1、2、7只有378 bp的單一條帶，無敲除效果；但是泳道3、4、5、6、8、9中在目的條帶的下方還出現了一條亮度微弱的條帶，顯示敲除成功，獲得F0代突變等位基因嵌合體斑馬魚。

2.4 wbp11突變等位基因的TA克隆和Sanger測序分析及wbp11突變等位基因雜合斑馬魚的篩選

由于F0代的成魚是嵌合體，所產生的基因突變不一定能夠遺傳給后代，因此，需要進一步的鑒定wbp11突變等位基因雜合胚胎即F1代胚胎的遺傳有效性。部分鑒定結果如圖5所示：泳道1在目的條帶下面還有一條與目的條帶亮度均等的條帶，顯示為雜合胚胎；泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、11只有目的條帶，顯示為未突變胚胎。這表明F0產生的突變能夠穩定遺傳。

待F1代斑馬魚長至3個月后進行鑒定。部分鑒定結果如圖6所示：泳道1、2、3、4、5、6、10、13、15只有野生型條帶，顯示為野生型斑馬魚；泳道7、8、9、11、12、14除了目的條帶之外，還有一條小于野生型且亮度均等的條帶，顯示為雜合子斑馬魚。

為了確認wbp11基因敲除的條帶的實際大小，本試驗將上述顯示敲除成功的雜合子（泳道7、8、9、11、12、14）的缺失條帶送往公司進行Sanger測序。測序結果比對顯示：泳道7、9為同一種類型缺失，缺失片段為27 bp（圖7a）；而泳道8、11、12、14為另一種類型缺失，缺失片段也為27 bp（圖7b），只是缺失的位點不同。最終在F1代斑馬魚中篩選出了2種不同類型的基因突變品系。

缺失片段均為27 bp，對缺失序列進行了序列分析，如圖8所示，2個突變品系缺失27 bp后，均能導致后續翻譯移碼，蛋白質不能正常翻譯。這表明構建的敲除品系缺失為有效缺失。

2.5 wbp11基因突變體純合子的篩選及mRNA

表達量的檢測

為了構建完整的斑馬魚基因敲除品系，將上述F1成魚進行雜交得到F2代，并鑒定篩選其中的純合突變體斑馬魚。以突變品系1為例，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖9所示，泳道4、5、6、8、9、10、11、15、18為野生型斑馬魚，而泳道1、3、7、12、13、14、16、17、19、20為wbp11基因突變等位基因雜合斑馬魚，泳道2、21為wbp11突變等位基因純合斑馬魚。此21條wbp11突變等位基因雜合斑馬魚自交所產生的F2后代中有9條野生型、10條突變雜合斑馬魚和2條突變純合斑馬魚，表明wbp11基因敲除品系構建成功。

隨后檢測了wbp11基因在野生型斑馬魚和突變品系1純合突變斑馬魚中的表達量，結果如圖10所示，純合突變斑馬魚wbp11基因的表達量極其低下，表明基因敲除成功。

2.6 wbp11基因突變純合斑馬魚呈現心臟、骨骼畸形

2種突變品系所表現出來的缺陷表型高度一致，選取突變品系1的wbp11-/-和野生型斑馬魚進行觀察，發現該基因的突變導致胚胎發育到48 hpf時出現明顯異常。白光成像側面圖（圖11）顯示，wbp11-/-斑馬魚出現心臟線性化、心包水腫、骨骼彎曲等畸形。

3 討論

已有研究顯示，WBP11基因敲低影響非洲爪蟾胚胎的早期發育，其中胚層標記WNT8、FGF4和CDX4的表達減少［15］。但對于WBP11基因在早期發育中的作用機制還未有報道。另有研究顯示，人類WBP11基因突變會導致先天性心臟病的發生，而小鼠的wbp11突變純合子胚胎出生后致死，雜合突變體胚胎出現脊椎、腎臟和食道的缺陷，腦部體積減少，但未觀察到心臟畸形［14］。因此，無法通過小鼠模型來研究wbp11基因的突變對于小鼠心臟發育的影響。而斑馬魚作為模式生物，所產下的胚胎光學透明，可以定時定點地觀察特定發育窗口期間斑馬魚胚胎的心臟形態、血液流動等發育情況［16-18］。并且，斑馬魚基因與人類基因具有70%的同源性［19-20］，除了研究胚胎發育外，還能夠利用斑馬魚模型建立如肝癌發生［21］、遺傳性肌肉疾病［22］、神經系統疾病［23］、心血管疾病［24-25］等多種人類疾病模型。因此，選擇利用斑馬魚構建wbp11基因敲除品系，能為人類先天性心臟疾病提供可能的疾病動物模型，也能為查明WBP11基因在不同脊椎動物中是否發揮不同作用提供研究材料。

CRISPR/Cas9技術由于其簡便、高效，已廣泛應用于基因敲除品系的構建［26-27］。本試驗利用CRISPR/Cas9技術敲除效率高、能穩定遺傳的特點構建了斑馬魚wbp11基因敲除品系。在構建品系的過程中發現，F0代嵌合體測交后代中出現少量心臟畸形的胚胎。鑒定結果顯示，畸形胚胎均為wbp11基因雜合突變體。檢測F1代自交后代時，其野生型：雜合子：純合子的比例約為5：5：1，較正常情況下1：2：1的比例相差較遠，顯示雜合子和純合子成魚的數量都明顯較少。但在前期并未觀察到胚胎或幼魚大量死亡，也未發現純合致死現象，推測可能是由于在胚胎發育早期，斑馬魚是通過擴散作用從水中吸收氧氣，而不是依賴心血管提供氧氣，即使是心血管嚴重異常的斑馬魚也能在整個胚胎發育和幼魚階段存活［28］，直到發育后期，wbp11基因突變對斑馬魚早期胚胎發育所造成的影響才顯現出來。因此并未在早期發現大量的胚胎死亡，但隨著幼魚的進一步發育，幼魚死亡數量增多，所得到的純合子和雜合子成魚數量均不符合孟德爾遺傳定律。

48 hpf時期的斑馬魚心房、心室發育完成，可自由游泳，此時能更好地觀察斑馬魚的心臟和骨骼形態［29］。在wbp11基因敲除的2個突變品系中，均觀察到48 hpf的斑馬魚幼魚出現心包水腫、心臟線性化、骨骼彎曲等畸形，這表明，wbp11基因突變干擾了斑馬魚的早期胚胎發育，尤其是心臟發育。由此推測，wbp11基因突變后，斑馬魚心臟和骨骼發育相關基因的RNA剪接受到了影響，從而造成某些重要基因無法正常的轉錄翻譯，繼而影響了心臟、骨骼的發育。但在斑馬魚中并未觀察到如小鼠一般的wbp11基因突變純合致死的情況，推測可能是因為wbp11的主要功能是參與前體mRNA剪接，但組成剪接體并參與剪接的蛋白質并非wbp11一種，機體的剪接機制并未完全廢除，可能在斑馬魚中存在某種還未發現的剪接代償機制。WBP11（wbp11）基因在不同物種中所表現出的缺陷表型不一致，也有可能是由于物種差異性所引起的。而對于wbp11如何影響斑馬魚的心臟、骨骼發育的作用機制，是否還影響了其他器官的發育以及機體的剪接機制是否出現異常還有待后續的深入研究。

總之，本試驗所構建的斑馬魚wbp11基因敲除品系為后續探究wbp11基因突變影響斑馬魚早期胚胎發育的作用機制打下了基礎。

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