構建宮頸癌銅死亡相關基因的預后模型和預測免疫治療反應

薛莘子 趙悅 張丹 徐丹穎 王俠

摘 要：為了探究銅死亡相關基因在宮頸癌（CC）中的預后價值，從TCGA數據庫下載CC患者的臨床資料，隨機分為訓練組和驗證組。通過單因素Cox、LASSO-Cox和多因素Cox分析篩選出銅死亡相關基因，構建風險模型。通過Kaplan-Meier曲線分析兩個亞組和整個隊列的總生存期（OS）、受試者工作特征曲線（ROC）和主成分分析（PCA）驗證模型的預后價值。通過單因素和多因素分析來評價臨床特征和風險評分的獨立預后價值。利用基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KGEE）富集分析兩個亞組間的生物學功能和途徑，并進一步分析了兩個亞組對藥物的敏感性。最終構建了5個與銅死亡相關基因（FXD1、ARF1、APP、HSF1、MT1A）的預后模型。從風險評分的生存曲線來看，低風險組的OS遠超過高風險組，且預后良好（P<0.05）。單因素和多因素Cox分析表明，風險評分是獨立的預后因素（P<0.001）。根據ROC和PCA證明了預后模型的預測能力。利用ROC曲線分析評估風險評分和其他臨床特征（如年齡、分級和分期）的敏感性和特異性，結果表明，風險評分的預后價值優于其他臨床特征。富集分析結果表明，基因功能主要富集于細胞外基質、細胞外結構。根據腫瘤免疫功能障礙與排斥（TIDE）算法，低風險組患者的免疫治療療效優于高風險組。此外還發現24種藥物的敏感性在兩個亞組中的顯著差異。本研究建立了5個銅死亡相關基因組成的預后風險模型，并證明了該模型可以準確預測患者的預后，且低風險評分的患者更易從免疫治療中獲益，為臨床個體化治療提供理論依據。

關鍵詞：宮頸癌；銅死亡相關基因；風險模型；免疫治療；預后

中圖分類號：R737.3 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.009

Construction of the Prognostic Model for Cuproptosis-related Genes Prediction of the Immunotherapy Response in Cervical Cancer

XUE Xinzi1， ZHAO Yue1， ZHANG Dan1， XU Danying1， WANG Xia2*

（1. Graduate school， Xuzhou Medical University， Xuzhou 221000， China;

2. Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou 221000， China）

Abstract： To explore the prognostic value of cuproptosis-related genes in cervical cancer， the clinical data of cervical cancer patients were downloaded from the TCGA database and randomly divided into training group and validation group. Cuproptosis-related genes were screened out by univariate Cox， LASSO-Cox and multivariate Cox analysis， and the risk model was constructed. Overall survival （OS） of the two subgroups and the entire cohort was analyzed by Kaplan-Meier curve， and the prognostic value of the model was verified by ROC curve and PCA. Univariate and multivariate analyses were performed to evaluate the independent prognostic value of clinical features and risk scores. The biological functions and pathways between the two subgroups were analyzed by gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia enrichment of genes and genomes （KGEE）， and the sensitivities of the two subgroups to drugs were further analyzed. Finally， prognostic models of five cuproptosis-related genes （FDX1， ARF1， APP， HSF1， MT1A） were constructed. From the survival curve of risk score， OS in the low-risk group was much higher than that in the high-risk group， and the prognosis was good （P<0.05）. By univariate and multivariate Cox analysis， risk score an independent prognostic factor （P<0.001）. The predictive power of the prognostic model was demonstrated by receiver operating characteristic curve （ROC） and principal component analysis （PCA）. ROC curve analysis was used to assess the sensitivity and specificity of risk scores and other clinical features， such as age， grade， and stage. And the results showed that the prognostic value of risk scores was superior to other clinical features. The results of enrichment analysis showed that gene function was mainly concentrated in extracellular matrix and extracellular structure. According to TIDE algorithm， immunotherapy efficacy of patients in the low-risk group was superior to that in the high-risk group. In addition， significant differences were found in the sensitivity of 24 drugs between the two subgroups. The study established a prognostic risk model composed of 5 cuproptosis-related genes， and proved that the model can accurately predict the prognosis of patients. And patients with low risk score are more likely to benefit from immunotherapy， which provides theoretical basis for clinical individualized therapy.

Key words： cervical cancer; cuprotosis related genes; risk model; immunotherapy; prognosis

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 259-271）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，手術、化療和放療已成為其傳統治療方法［1-2］。早期CC的局部病灶可通過手術、放療或化療獲得良好的療效，而傳統治療對晚期/復發性婦科腫瘤效果不佳，5年生存率僅16.8%。因此，晚期/復發性CC的治療非常棘手，當一線治療方案（順鉑、紫杉醇聯合貝伐珠單抗）失敗時，后續治療的有效率非常低，預后極差。近幾年熱點的免疫治療為這些晚期/復發性CC患者提供了新的治療選擇，甚至為治療無望的患者帶來了治愈的可能［3-5］。然而，梁金曉等［6］的研究表明，免疫藥物對大多數晚期/復發性婦科腫瘤患者無效（原發性耐藥），或療效持續時間短（繼發性耐藥），這成為免疫治療的瓶頸［7］。已有研究［8-9］ 表明，免疫治療對復發或晚期CC患者療效顯著，并取得了很大突破。目前，臨床上常用的預測藥物療效的分子標志物預測價值有限。因此，尋找更有效的分子標志物以及可能對免疫治療有效的患者，及時準確地評估免疫治療的療效，具有重要的臨床意義。

Tsvetkov等［10］在2022年首次提出了一種全新的、具有銅依賴性的細胞死亡模式——“銅死亡（cuprotosis）”。不同于其他被知曉的細胞死亡模式，如凋亡、焦亡和壞死，相對于鋅死亡和鐵死亡，銅死亡是一種金屬離子誘導的調節性細胞死亡，與線粒體呼吸密切相關［10-11］。機體內銅的攝取、排泄以及代謝受多種因素調節并保持動態平衡。其過多或過少都會導致一定的后果，過少會影響與金屬結合酶的結合，使其功能異常；過多則會破壞細胞，導致細胞死亡［12-13］。而越來越多的證據表明，銅代謝與腫瘤發生有關，腫瘤細胞比正常細胞需要更高水平的銅［14-17］。一些腫瘤細胞表達高水平脂酰化的線粒體蛋白，并表現出高水平的呼吸活性。各種類型的癌癥已被證明與腫瘤組織中銅含量的增加和（或）體內銅分布的改變有關（如乳腺癌［15］、CC［17］），并且減少腫瘤內銅離子含量可以增強免疫治療。因此，在銅代謝過程中涉及的因素可能成為CC患者的潛在預后標志物和治療靶點。

本研究基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas program，TCGA）數據庫，篩選出5個與銅死亡相關的基因，構建風險評分模型，并進一步驗證了該模型具有一定的預測價值。此外，研究中免疫治療的療效評價及藥物敏感性對后續臨床治療更具指導意義。

1 材料與方法

1.1 收集數據

從TCGA數據庫中獲得CC患者的臨床資料。本研究包括304例臨床信息的樣本，包括年齡、分級、臨床TNM分期（tumor node metastasis classification）。從既往文獻中獲得19個銅死亡相關基因，結合分子特征數據庫（GOBP_CELLULAR_COPPER_ION_HOMEOSTASIS， GOBP_CELLULAR_RESPONSE_TO_COPPER_ION）并剔除重復，最終篩選出49個銅死亡相關基因［10，18-19］。

1.2 構建預后模型

將304名CC患者分為訓練組和驗證組，結果顯示，這兩個亞組的臨床特征沒有顯著差異。利用單因素、LASSO‐Cox回歸［20］和多因素Cox回歸分析篩選銅死亡相關基因，并根據風險評分計算公式計算每個患者的風險評分。風險評分=FDX1×（-0.743 203 703 700 511）+ARF1×1.014 682 357 424 06 + APP×0.439 512 746 165 105 +HSF1×1.123 473 309 358 06 + MT1A×0.407 713 075 452 012。

1.3 驗證風險模型

將臨床數據與風險評分相結合，計算出中位風險評分和相應系數，根據結果將訓練組和驗證組的患者分為高危組和低危組。利用單因素和多因素Cox分析來進一步確定風險評分是否是獨立的預后因素。利用Kaplan-Meier曲線分析高、低風險組的總生存期（overall survival，OS）。此外，主成分分析（principal component analysis，PCA）和受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）用于評估預后模型的預測能力。使用單因素和多因素Cox回歸來驗證風險模型的獨立預后作用并建立列線圖，并且通過繪制校準曲線評估列線圖的準確性。

1.4 預后風險評分與臨床分期關系的探討

為了評估不同分期預后模型的預測價值，并將其應用于不同臨床分期的患者，采用單因素和多因素Cox回歸分析研究風險評分與臨床分期的關系。

1.5 腫瘤內免疫細胞浸潤和免疫治療的評價

為了分析風險評分與免疫細胞及功能之間的相關性，使用單樣本基因集合富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）來評估腫瘤免疫細胞的浸潤和功能，并構建相關熱圖。通過腫瘤免疫功能障礙與排斥（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）算法模擬腫瘤免疫逃逸機制來預測免疫治療療效［21］，計算患者的得分，分析兩個亞組免疫治療的反應。

1.6 功能富集分析

對篩選出的銅死亡相關基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，分析其生物學機制和相關信號通路。

1.7 計算腫瘤突變負荷分數

腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）與腫瘤免疫治療反應密切相關［22-23］。使用從TCGA數據庫下載的CC患者樣本的突變數據，比較兩個亞組之間的突變分數，并分析其與風險評分的關系。瀑布圖直觀地揭示了風險評分和TMB之間的關系。

1.8 藥物敏感性評價

IC50（half maximal inhibitory concentration）代表受試拮抗劑的半數抑制濃度。共有138種藥物被納入腫瘤藥物敏感性基因組學數據庫（genomics of ?drug sensitivity in cancer，GDSC）。通過“pRRophetic”和“ggplot2”軟件包［24］，分析常見抗腫瘤藥物在高危組和低危組中的敏感性差異，并用箱線圖進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 風險模型的構建與驗證

基于TCGA數據庫，我們選取了49個銅死亡相關基因和304個臨床資料，通過單因素Cox分析和LASSO-Cox回歸分析篩選出6個銅死亡相關基因（圖1a），并確定了基因回歸系數的軌跡變化和模型構建的交叉驗證結果（圖1b～1c）。隨后進行多次多因素COX回歸分析，篩選出5個與預后相關的基因來建立預后模型。根據中位風險評分將患者分為高、低風險組。風險評分的Kaplan-Meier曲線表明，風險評分高的CC患者預后差，OS低（P<0.05，圖1d～1f）。通過圖1g～1i，我們可以看到風險分值的分布和患者的存活率，隨著風險評分的增加，死亡人數增加，存活時間減少。如圖2a顯示，低風險組患者的無進展生存期（progression free survival，PFS）明顯高于高風險組患者（P<0.001）。通過以上分析，我們可以得出結論：隨著風險評分的增加，患者的死亡風險增加，生存時間減少，預后差。

2.2 預后因素的獨立預后價值和臨床特征

為了驗證風險評分和其他臨床數據是否可以作為獨立的預測因素，我們進行了單因素和多因素Cox回歸。結果顯示：在單因素分析（圖2b）中，T分期和風險評分是獨立的預后因素（P<0.001）；在多因素分析（圖2c）中，風險評分仍是5個臨床特征中的獨立預后因素（P<0.001）。ROC曲線下面積（area under curve，AUC）結果分析表明，此模型具有較高的預測能力和準確性（圖2d），1年、3年和5年的AUC分別為0.751、0.736和0.748。利用ROC曲線分析了風險評分、年齡、分級和分期的敏感性和特異性（圖2e）。此外，我們還通過C指數分析得出，風險評分的敏感性和特異性明顯高于其他臨床特征（圖2f）。基于諾模圖，評估每個預后因素對CC患者1年、3年和5年OS的預測能力（圖2g）。從圖2h可以看出，校準圖與諾模圖的預測結果非常吻合。為了更好地應用于臨床，我們研究了不同分期與風險評分的關系。結果顯示，風險評分可以準確預測不同臨床分期患者的預后（P<0.05，圖3a～3b）。此外，PCA分析揭示了兩組之間的高度差異（圖3c～3d）。通過比較高危組和低危組的13種免疫功能富集譜，我們發現，9種免疫功能富集譜在兩個亞組是不同的，并且它們都在低風險組中富集（圖3e）。

2.3 功能富集分析

通過差異表達基因（differential expressed genes，DEGs）的GO和KEGG富集分析高低風險組人群之間的生物學功能和途徑的差異，進一步篩選出對生物體有意義的基因，為不同風險群體的預后結局及藥物治療效果差異提供證據。GO分析由生物過程、細胞組成和分子功能分析組成。生物過程主要涉及細胞外基質組織、細胞外結構組織和對生長因子刺激的反應。在細胞成分中，它主要集中在含膠原蛋白的細胞外基質、內質網腔、基底膜和血液微粒。分子功能主要與細胞外基質結構成分、受體配體活性和信號受體激活劑活性有關（圖4a、4c、4e）。KEGG分析表明，基因主要富集于人類白細胞抗原、T細胞共刺激、炎癥促進、檢查點和抗原提呈細胞聯合抑制（圖4b、4d、4f）。基因集變異分析（gene set variation，GSVA）用于比較高風險組和低風險組之間的基因富集途徑（圖5a～5b）。

2.4 腫瘤免疫細胞浸潤和免疫治療的評價

使用ESTIMATE算法比較CC高危組和低危組之間的間質評分、免疫評分、估計評分和腫瘤純度（圖6a～6b），結果顯示，CC患者的低風險組具有較高的免疫評分和估計評分，但腫瘤純度較低。為了進一步探討腫瘤細胞與免疫浸潤之間的關系，基于ssGSEA，計算出23種免疫細胞的免疫浸潤分數。如圖6c所示，Activated B cell（P<0.001）、Activated CD4 T cell（P<0.001）、Activated CD8 T cell（P<0.001）、Immature B cell（P<0.001）和MDSC（P<0.01），這些免疫浸潤細胞在高危組和低危組存在顯著差異，在低風險組體內有較高豐度的抗腫瘤免疫細胞，這可能部分解釋了亞組間預后的顯著差異。最后，我們使用CIBERSORT算法評估風險評分以及模型相關基因與腫瘤免疫浸潤細胞的相關性（圖6d）。根據TIDE算法結果顯示，高危組與低危組之間的TIDE評分有統計學意義，低危組患者的免疫治療療效優于高危組（P<0.001，圖6e）。

2.5 腫瘤突變負荷

瀑布圖顯示了兩組中突變頻率最高的15個基因。圖7a～7b 結果顯示，TTN是低風險組和高風險組中突變分數最高的基因。TMB是近年來在多種腫瘤免疫治療中發現的可用于預測免疫治療的獨立生物標記物［25］。高TMB患者產生的新抗原多，腫瘤會被大量腫瘤特效異性T細胞攻擊，抗PD-1/PD-L1抗體治療可以使腫瘤T細胞反應得以更充分的發揮，因此，高TMB的患者對免疫檢查點抑制劑治療臨床獲益更大（圖7c）。腫瘤突變負荷和風險評分的的組合生存分析相結合可以得到組合生存曲線。圖7d 結果表明， TMB和風險評分的組合可以更有效地預測生存率，對CC患者的OS有顯著影響。

2.6 藥物敏感性與風險評分的關系

為了研究CC患者的風險評分與藥物IC50的關系，以P<0.05為篩選標準，共獲得24種藥物，分析了24種常見抗癌藥物在高危組和低危組之間的敏感性，如圖8～9所示。其中阿糖胞苷（cytarabine）、伊馬替尼（imatinib）、米哚妥林（midostaurin）和帕唑帕尼（pazopanib）在高危人群中具有更低的IC50值和更低的風險，這表明高危人群中的患者對這些藥物高度敏感。而貝利司他（belinostat）等藥物對低危患者的敏感性較高。通過上述結果，我們可以在臨床上針對不同的患者群體提供針對性的藥物，從而改善患者的預后。

3 討論

銅死亡是一種新發現的細胞死亡方式，關于CC銅死亡相關基因的研究很少有論文發表，本研究就銅死亡相關基因與CC預后及免疫治療的反應展開討論。在本研究中，通過單因素、多因素及LASSO-Cox分析篩選出5個基因（FDX1、ARF1、APP、HSF1、MT1A）。ARF1可能激活以高爾基體為主平臺的MAPK通路，進而激活細胞質RSK1，導致細胞增殖［26］。Zhang等［27］ 的研究表明，FDX1與葡萄糖代謝、脂肪酸氧化和氨基酸代謝密切相關，也是肺腺癌治療的潛在靶點。還有研究表明，FDX1可能通過影響各種癌癥類型中的免疫浸潤來調節腫瘤免疫微環境，其表達可能與治療反應的評估有關，FDX1可能成為癌癥監測和未來研究的生物標志物和潛在治療靶點［28］。據報道，APP與人類惡性腫瘤相關，如結腸癌、胰腺癌、肺癌、甲狀旁腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和前列腺癌［29］。根據APP表達研究，APP沉默減少了癌癥增殖，促進了細胞凋亡并增加了治療敏感性［30］。有證據表明，HSF1通過MDTH-VEGF- C的表達促進CC的侵襲和轉移［31］，Hurley等［32］揭示了HSF1信號通路可以抑制肝母細胞瘤細胞的凋亡。綜上所述，這些基因在癌癥的發生進展中起重要作用，但在CC中具體的作用機制還需要進一步探索。

隨后，本文對上述風險模型進行了驗證，Kaplan-Meier曲線顯示，高危組的CC患者預后不良（P<0.05）。AUC結果表明，該模型具有較高的預測能力。C指數曲線和ROC曲線結合臨床特征分析表明，風險評分的預測準確率高于其他臨床特征，其臨床應用前景廣闊。GO、KEGG富集分析表明，表達量有差異的基因都集中在細胞外的構成和功能上，由此可以推測，細胞外的構成和功能參與了癌癥的發生發展。ssGSEA結果說明，腫瘤組織里面還包含有很多免疫細胞，其中Activated B cell、Activated T cell、Activated CD8 T cell、Immature B cell是適應性免疫細胞執行抗腫瘤功能。 MDSC是先天性免疫細胞具有免疫抑制功能，在抗腫瘤中起著關鍵作用，并且在低風險組患者的腫瘤微環境中具有更多的抗腫瘤免疫浸潤細胞。此外，本研究發現低危組的TIDE評分明顯高于高危組，高TMB的腫瘤患者具有獲得更多新生抗原的潛力，能增強腫瘤免疫原性以及與免疫檢查點抑制劑的反應，在臨床上免疫治療獲益更好。這些發現日后都可以成為預測免疫治療有效性的工具，更好地服務于臨床。此次研究篩選出的24種藥物，其藥物敏感性在兩個組別中差異有統計學意義，為臨床治療中的藥物選擇提供了理論支持。

首先，由于本研究只使用TCGA數據庫中的數據，具有局限性；其次，我們沒有進行外部驗證，增加模型預測的可靠性和真實性；最后，利用生物信息學已經篩選出的基因，其具體作用機制目前還未闡明，需要進一步探討研究。

總的來說，本研究構建了CC銅死亡相關基因預后模型，并驗證了其預測的準確性和診斷價值，低風險組的患者對免疫治療的療效優于高風險組，可以在后續的臨床治療中為患者提供更精確的治療方案，改善CC患者的預后。

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