雪蓮果提取物調(diào)控Nrf2/HO-1/NLRP3通路改善大鼠急性肝損傷的作用機制研究

陳順芝 馮玲 楊琪 張紫玉 吳蒸麗 張永勤

摘 要：基于Nrf2/HO-1/NLRP3通路探究雪蓮果提取物治療四氯化碳（CCl4）致急性肝損傷（ALI）大鼠的保護作用及機制。選取48只健康雄性SD大鼠，隨機分為6組，分別為對照組、模型組、雪蓮果低中高劑量組和水飛薊素陽性組。利用CCl4構(gòu)建急性肝損傷模型后處死大鼠取材，檢測大鼠血清和肝臟生化指標，利用HE染色觀察各組肝臟組織病理學(xué)改變情況；利用ELISA檢測大鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表達水平；采用蛋白免疫印跡法測定大鼠肝組織中Nrf2/HO-1/NLRP3通路關(guān)鍵基因蛋白含量表達情況。結(jié)果表明：與正常對照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、MDA、IL-6和TNF-α的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；肝臟組織中SOD和GSH的表達水平均顯著降低（P<0.05），大鼠肝組織細胞出現(xiàn)明顯的病理性損傷（P<0.05）；與模型組比較，雪蓮果提取物能夠呈劑量依賴性降低大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT、IL-6和TNF-α的表達水平（P<0.05或P<0.01），以及提高肝臟組織中SOD、CAT、GSH和降低MDA的表達水平（P<0.05），大鼠肝組織病變程度明顯改善，肝臟內(nèi)細胞壞死和腫脹程度明顯減輕，炎癥細胞浸潤得到顯著改善。水飛薊素陽性組能夠顯著改善大鼠肝損傷（P<0.05或P<0.01）。雪蓮果提取物組與模型組比較，Nrf2、GCLC、NQO1和HO-1蛋白表達水平呈劑量依賴性升高（P<0.05或P<0.01）；NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白（NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-18）表達水平呈劑量依賴性降低（P<0.05或P<0.01）。雪蓮果提取物對CCl4所致的大鼠急性肝損傷具有保護作用，該作用可能與調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路改善氧化應(yīng)激，降低脂質(zhì)過氧化，清除大鼠體內(nèi)自由基，抑制NLRP3炎癥小體的功能，減少炎癥因子的合成與釋放以及降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：雪蓮果提取物；急性肝損傷；Nrf2/HO-1通路；NLRP3炎癥小體；氧化應(yīng)激

中圖分類號：R287? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.010

Effects of Extract of Yacon on Nrf2/HO-1/NLRP3 Pathway on Acute Liver Injury in Rats

CHENG Shunzhia， FENG Lingb， YANG Qib， ZHANG Ziyub， WU Zhenglib， ZHANG Yongqina*

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine ?a. Department of Basic Medicine; b. Department of Pharmacy， Guiyang 550025， China）

Abstract： Based on Nrf2/HO-1/NLRP3 pathway， the protective effects and mechanism of yacon extract on acute liver injury （ALI） induced by carbon tetrachloride （CCl4） in rats were investigated. Forty-eight healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups： control group， model group， low， medium and high dose group and silymarin positive group， in which ALI model was established with CCl4 and the rats were sacrificed for sampling， and the serum and liver biochemical indexes of rats were detected. HE staining was used to observe the histopathological changes of liver in each group， and ELISA was used to detect the expression levels of inflammatory cytokines IL-6， TNF-α and IL-1β in serum of rats. The relative expression of Nrf2/HO-1/NLRP3 pathway related proteins in rat liver was determined by Western blot. The results showed that compared with normal control group， the expression levels of AST， ALT， ALP， γ-GT， MDA， IL-6 and TNF-α in serum of rats in model group significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression levels of SOD， CAT， and GSH in liver tissue were significantly decreased （P<0.05）. The pathological injury of rat liver tissue cells was obvious （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the extract of yacon could decrease the expression levels of AST， ALT， ALP， γ-GT， IL-6 and TNF-α in serum in a dose-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）， which increase the expression levels of SOD， CAT and GSH and decrease the expression levels of MDA in liver tissue （P<0.05）. The degree of liver tissue lesions in rats was significantly improved， which the degree of liver cell necrosis and swelling was significantly reduced， and the inflammatory cell infiltration was significantly improved. Silymarin positive group significantly improved rat liver injury （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the protein expression levels of Nrf2， GCLC， NQO1 and HO-1 in the extract group and positive control group dose-dependenty increased （P<0.05 or P<0.01）. The expression levels of NLRP3 inflammator-related proteins （NLRP3， Caspase1， GSDMD and IL-18） were reduced in a dose-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）. Yacon extracts have a protective effect on acute liver injury in rats caused by CCl4， in which the effect may be related to regulating Nrf2/HO-1 pathway to improve oxidative stress， reducing lipid peroxidation， removing free radicals in mice， inhibiting inflammatory corpuscle NLRP3 function， reducing the synthesis and release of inflammatory factors and reducing inflammation.

Key words： yacon extract; acute liver injury; Nrf2/HO-1 pathway; NLRP3 inflammasome; oxidative stress

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 272-281）

急性肝損傷（acute liver iniury，ALI）主要表現(xiàn)為代謝障礙、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡以及肝臟功能的喪失等癥狀，輕度的急性肝損傷可逐漸自愈或轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿螕p傷，進而引發(fā)肝纖維化、肝硬化或者肝癌，而重度的急性損傷可進展成為具有極高死亡率的急性肝衰竭。對于急性肝損傷，現(xiàn)階段除肝移植之外尚無有效的治療方法［1］。因此，尋找安全藥效的食品或藥物對于早期治療或干預(yù)急性肝損傷，以及干預(yù)急性肝損傷的發(fā)生具有重要的意義。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是經(jīng)典的誘導(dǎo)化學(xué)性急性肝損傷動物模型的外源性化合物，常用于研究保肝藥的藥效和分子作用機制［2］。目前，能夠治療化學(xué)性誘導(dǎo)的急性肝損傷藥物遠不能滿足市場需求，研發(fā)天然植物藥物或藥食同源食物來防治急性肝損傷對于保護易感人群免受化學(xué)毒物的傷害至關(guān)重要。雪蓮果（Smallanthus sonchifolius）又名亞貢，屬菊科，葵花屬植物，其形狀像紅薯，是一種菊科多年生草本植物。目前從雪蓮果中分離出的化學(xué)成分達140種，主要有綠原酸（chlorogenic acid）、黃酮（flavonoids）、倍半萜內(nèi)酯（sesquiterpene lactone）、低聚果糖（fructooligosaccharides）、脂肪酸（fatty acid）等成分，此外還有甾醇（sterol）、二萜（diterpenoids）、對羥基苯乙酮（p-hydroxyacetophenone）衍生物以及辛酮糖酸（octulosonic acid）衍生物類等物質(zhì)，可以幫助消化，增強胃動力，排毒通便，養(yǎng)顏美容，此外還具有降血糖、保肝利膽、降血脂等藥理作用［3-4］。大量的研究表明，肝損傷與氧化應(yīng)激有著密切的關(guān)系，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2 （nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）屬于堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，控制著II期解毒抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，如血紅素加氧酶-1 （heme oxygenase 1，HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase catalytic，GCLC）和醌氧化還原酶-1 （quinone oxidoreductase 1，NQO1）等的表達，缺乏Nrf2的動物抗氧化防御能力低，極易受到氧化應(yīng)激引起的各種損傷［5-6］。大量研究表明，一些草藥和膳食中的多酚可以通過激活Nrf2信號通路來保護肝臟免受損傷［7-8］。因此，Nrf2被認為是氧化應(yīng)激的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。

近期研究表明，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 （NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）參與了炎癥性肝病的發(fā)生，NLRP3炎性小體是在肝細胞和肝實質(zhì)細胞中表達的細胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)［9-10］。NLRP3炎癥小體是由NLRP3組成的多蛋白復(fù)合體，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱天冬酶-1前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1， pro-caspase-1）組成。當NLRP3炎性小體被激活時，激活的炎性小體促使ASC將pro-caspase-1切割成為具有活性的Caspase-1，而具有活性的Caspase-1將IL-1β（interleukin-1β）前體和IL-18（interleukin-18）前體變?yōu)橛谢钚缘腎L-1β和IL-18，并切割GSDMD（gasdermin-D），其N端在細胞膜上成孔，導(dǎo)致細胞腫脹破裂，炎癥因子大量釋放到胞外，從而引發(fā)細胞的焦亡［11］。研究表明，在CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷中，NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達水平上調(diào)，說明NLRP3的激活促進了Caspase-1和IL-1β，參與CCl4誘導(dǎo)的肝損傷［12］。因此，抑制該信號通路的傳導(dǎo)可以有效地抑制肝損傷的進程，對肝臟疾病治療有非凡的意義。水飛薊素是從水飛薊果中提取的一種活性素，有清除活性氧、對抗脂質(zhì)過氧化、促進肝細胞修復(fù)和再生等功能，在臨床上常被用于治療急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等疾病［13］。為了進一步明確雪蓮果對急性肝損傷的保護作用及其抗氧化作用機制，本研究擬采用CCl4構(gòu)建急性肝損傷動物模型，基于Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路探討雪蓮果對CCl4致大鼠急性肝損傷的保護作用及作用機制，為研究雪蓮果保肝護肝的作用機理提供理論基礎(chǔ)，為進一步開發(fā)雪蓮果相關(guān)產(chǎn)品提供試驗依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

健康SPF級SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠48只，體重（250±20）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。試驗動物使用許可證：SCXK（湘）2019-0013。大鼠保持在一個12 h光/12 h暗的循環(huán)中，溫度和濕度適中，允許自由獲得食物和水。動物飼養(yǎng)和試驗設(shè)計均遵循國家醫(yī)學(xué)試驗動物管理實施細則，所有動物處理均獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的批準。

1.1.2 藥品與試劑

雪蓮果莖根（yacon root）購自云南省崇明市；水飛薊素（silymarin）購自西安天廣源生物科技有限公司；CCl4購自南京化學(xué)試劑有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶

（alanine，ALT）檢測試劑盒（批號：20211021）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate，AST）檢測試劑盒（批號：20211020）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）檢測試劑盒（批號：20211021）、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamic acyltransferase，γ-GT）檢測試劑盒（批號：20211022）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號：20210525）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（批號：20210325）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒（批號：20211228）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號：20211225）均購自南京建成生物工程研究所。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號：20201104）；TNF-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6（interleukin-6）和IL-1β ELISA Kit購自上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號：20210929）；抗體和顯色液購自上海生工生物股份有限公司。

1.1.3 試驗儀器

儀器1510全自動酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司； HH-W420恒溫箱購自江蘇金壇億通電子有限公司；MR2245普通切片機購自德國萊卡；KD-BM組織包埋機購自浙江金華科迪；Nikon DS-U3成像系統(tǒng)購自日本Nikon公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪蓮果提取物的制備

稱取若干去皮后的雪蓮果根莖，加入8～10倍蒸餾水，煎煮2次，加80%乙醇沉淀過夜，過濾、蒸餾和干燥后得到雪蓮果提取物，取該提取物加生理鹽水配成原藥為1 g/mL的藥液。

1.2.2 動物試驗分組

將48只雄性SD大鼠隨機分為6組，每組8只，分別是對照組、模型組、雪蓮果低劑量組［10 g/（kg·d–1）］、雪蓮果中劑量組［20 g/（kg·d–1）］、雪蓮果高劑量組［40 g/（kg·d–1）］和水飛薊素陽性組［200 mg/（kg·d–1）］。除正常對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水外，其余各組均灌胃相應(yīng)劑量雪蓮果提取物，水飛薊素陽性組灌胃相應(yīng)劑量的水飛薊素溶液（200 mg/kg），每日1次，連續(xù)給藥1周。末次給藥結(jié)束2 h后，除正常對照組大鼠腹腔注射等體積橄欖油外，其余組大鼠均一次性腹腔注射50% CCl4的橄欖油溶液（10 mL/kg）建立大鼠急性肝損傷模型。

1.2.3 標本采集

試驗動物在注射CCl4 24 h后左右采血，采血前隔夜禁食不禁水，秤重，予水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉，由腹正中線切皮，進入腹腔分離腹主動脈，經(jīng)腹主動脈采血。將獲得的各組大鼠血液室溫靜置2 h后，4℃、3 000 r/min離心15 min，得到各組大鼠血清，收集血清，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诔浞直┞队坞x肝臟后，在肝臟右葉中部距邊緣5 mm處用剪刀取肝組織小塊，一部分用液氮速凍在-80℃保存?zhèn)溆茫硗庖徊糠止潭ㄔ?0%多聚甲醛中用于相關(guān)指標的檢測。

1.3 樣品生化指標檢測

將獲得的各組大鼠血清，按照試劑盒說明書要求嚴格檢測各組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性。取大鼠肝臟組織0.1g左右，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，破碎混勻制成10%肝組織勻漿液，嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測肝臟組織中SOD和CAT的酶活性以及GSH和MDA的含量。利用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測各組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、 IL-6和IL-1β 的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，獲得各組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β 的含量。

1.4 HE染色

各組切取相同部位肝臟組織，用生理鹽水清洗后，10%低聚甲醛固定24 h；不同濃度乙醇脫水；二甲苯透明后進行石蠟包埋，將包埋好的樣品置于切片機上，并設(shè)置切片厚度為5 ?m進行切片；待切片完全展開整齊無褶皺后，用載玻片撈起放于鐵制載玻片架中。烘干后進行脫蠟和復(fù)水：1）依次將切片放入二甲苯Ⅰ中30 min→二甲苯Ⅱ中30 min→無水乙醇Ⅰ中5 min→無水乙醇Ⅱ中5 min→75%乙醇中5 min，自來水沖洗；2）蘇木素染色10 min，鹽酸水溶液分化30 s，氨水溶液返藍，流水沖洗；3）切片依次入85%和95%乙醇中梯度脫水，入伊紅染液中染色5 min；4）切片依次放入無水乙醇Ⅰ中10 min→無水乙醇Ⅱ中10 min→二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各5 min使之透明，中性樹膠封片；在普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變，進行病理學(xué)分析。

1.5 蛋白印跡法（Western blot）

分別取各組的肝臟組織約100 mg，加入1 mL蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，裂解離心吸取上清液。采用蛋白定量（bicinchoninic acid，BCA）試劑檢測方法測定總蛋白含量。取蛋白樣品加熱并混合上樣緩沖液，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進行電泳，聚偏氟乙烯轉(zhuǎn)膜，用5% BSA在室溫下孵育1 h，加入相應(yīng)Nrf2（#D121053）、HO-1（#D220756）、GCLC（#D222177）、GSDMD（#17535-1-AP）、Caspase-1（#D120080）、NQO1（#D120134）、NLRP3（#D120168）、IL-18（#D220073）和β-actin（#20536-1-AP）的一抗，4℃孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，得出灰度值。檢測目的蛋白表達水平，以β-actin為內(nèi)參照進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，試驗均重復(fù)3次，計量資料采用平均值±標準差（x±s）的形式表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪蓮果對CCl4誘導(dǎo)肝損傷大鼠血清生物

標志物的影響

血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的水平是評估肝損傷嚴重程度的標志。由圖1可見，在CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠中，模型組與正常對照組比較，血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，雪蓮果高中劑量組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平均顯著降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。陽性對照組與模型組相比，血清中ALT、AST、ALP、γ-GT的酶活性水平均顯著降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

2.2 雪蓮果提取物對各組大鼠肝臟抗氧化因子

及MDA水平的影響

細胞中SOD、CAT的酶活性及GSH的含量能夠反應(yīng)細胞的抗氧化能力。試驗結(jié)果顯示，模型組與對照組相比，大鼠肝臟中SOD、CAT活性及GSH、MDA含量均顯著改變且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。雪蓮果組與模型組相比，大鼠肝臟中SOD、CAT的活性均顯著升高，GSH的含量升高而MDA的含量降低，且呈劑量依賴性變化，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；陽性對照組與模型組相比，大鼠肝臟中SOD、CAT的活性均顯著升高，GSH的含量升高而MDA的含量降低，且呈劑量依賴性變化，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），具體結(jié)果見圖2。

2.3 各組大鼠肝損傷的組織病理學(xué)觀察

通過HE染色觀察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝臟組織未見異常，組織細胞分布均勻，肝索清晰，沒有細胞壞死、脂肪變性或炎癥細胞浸潤的出現(xiàn)。如圖3所示，CCl4誘導(dǎo)的模型組大鼠肝臟與對照組相比，模型組大鼠肝細胞呈緊張性脂肪變性，可見不同大小的脂肪液泡彌漫性分布，胞漿、肝細胞區(qū)可見大面積局灶性壞死并伴炎癥細胞浸潤增生。雪蓮果高劑量組和陽性對照組，與模型組比較，大鼠肝臟中的壞死性細胞明顯減少，炎癥細胞浸潤明顯減少，與模型組比較細胞完整性得到有明顯改善（P<0.05）。雪蓮果中劑量組與模型組比較，壞死性細胞明顯減少，炎癥細胞浸潤相對減少，細胞壞死情況得到相對改善（P<0.05）。雪蓮果低劑量組與模型組比較，壞死性細胞相對減少，炎癥細胞浸潤相對減少，但差異并不顯著（P>0.05）。

2.4 雪蓮果提取物對各組大鼠肝臟TNF-α、IL-6

及IL-1β水平的影響

血清中TNF-α、IL-6以及IL-1β均作為炎癥因子反映肝損傷程度和機體炎癥水平。如圖4所示，通過ELISA方法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平，與正常對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，雪蓮果高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低（P<0.05），陽性對照組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低（P<0.05），雪蓮果中低劑量組與模型組比較大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β差異不顯著（P>0.05）。

2.5 雪蓮果提取物對各組大鼠肝臟組織中Nrf2

相關(guān)基因蛋白水平的影響

利用Western blot技術(shù)檢測各組大鼠肝臟中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表達水平。如圖5所示，與正常對照組相比，模型組Nrf2蛋白的表達水平顯著降低（P<0.05），而HO-1和NQO1蛋白的表達水平相對升高（P>0.05）。雪蓮果組與模型組相比，肝臟中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表達水平呈劑量依賴性升高（P<0.05），陽性對照組與模型組比較，Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）。

2.6 雪蓮果提取物對各組大鼠肝臟組織中NLRP3相關(guān)基因蛋白水平的影響

利用Western blot技術(shù)檢測各組大鼠肝臟中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表達水平。如圖6所示，與正常對照組相比，模型組NLRP3、GSDMD、IL-18蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。雪蓮果組與模型組相比，肝臟中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表達水平呈劑量依賴性降低（P<0.05或P<0.01），陽性對照組與模型組比較，NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-18蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)雪蓮果提取物顯著改善了CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，能夠降低肝損傷大鼠血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的活性，降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中MDA的表達水平，提高肝臟組織中SOD、CAT和GSH的表達水平。同時，雪蓮果提取物能夠有效降低大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平，提高NRF2/HO-1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達，同時能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活來保護CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。肝損傷會導(dǎo)致各種肝臟疾病，尋找安全有效的藥物或藥食同源的食品對治療和預(yù)防肝損傷具有重要意義。CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是研究保肝護肝類藥物的經(jīng)典模型之一，其作用機制為CCl4進入機體后，最先進入肝臟進行代謝，在肝細胞中被細胞色素P450分解，產(chǎn)生三氯甲基等氧自由基，破壞細胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)［14］。氧自由基會促進細胞膜進行脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞肝細胞膜的完整性，進而增加細胞膜的通透性，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外流，致使細胞壞死腫脹［15］。肝細胞內(nèi)容物如ALT和AST持續(xù)外流進入血液當中，引起血清中ALT和AST活性升高。因此，血清中ALT和AST的水平也反映了肝臟受損的嚴重程度［16］。此外，脂質(zhì)過氧化會加大肝細胞的破壞導(dǎo)致ALP和γ-GT持續(xù)外流，引起血清中ALP和γ-GT水平顯著升高，而血清中ALP水平不僅是肝細胞受損的程度指標，也是臨床上檢測肝臟疾病的主要指標。當肝臟受損時會造成γ-GT排泄受阻，隨膽汁反流入血引起血清中γ-GT異常升高［17］。在脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生大量的MDA，其能夠加劇細胞膜的受損，因而MDA也可作為組織氧化應(yīng)激情況和過氧化程度的重要生物指標之一［18］。SOD和CAT均能消除或減輕細胞氧化損傷，能夠清除細胞內(nèi)氧自由基，當細胞內(nèi)過氧化水平升高時，SOD和CAT水平也會相應(yīng)上升來抵抗外界的過氧化，因此，SOD和CAT是機體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)［19］。還原性GSH具有較強的還原性，能中和細胞當中的氧化物質(zhì)，保護細胞膜的完整性，促進肝臟排泄和解毒，當細胞中氧化程度過高時會一定程度上消耗GSH，導(dǎo)致其含量較低［20］。本研究利用雪蓮果處理CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型，結(jié)果顯示，雪蓮果能夠顯著降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠血清中ALT、AST、ALP和γ-GT的水平（P<0.05），這表明雪蓮果能夠在一定程度上改善CCl4引起的肝損傷。此外，本研究發(fā)現(xiàn)雪蓮果能夠降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中SOD、CAT和MDA的表達水平（P<0.05），同時升高肝臟組織中GSH的表達水平（P<0.05），這說明雪蓮具有一定的抗氧化作用，可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激作用改善CCl4引起的肝損傷。

雪蓮果中主要含有綠原酸、黃酮和低聚果糖等成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抑菌、抗癌作用［21］。已有研究表明，綠原酸具有抗氧化作用，可以通過促進Nrf2入核，增強肝組織中HO-1、NQO1和GCLC的表達，進而改善肝損傷［22-23］。為了進一步明確雪蓮果改善CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的作用機制，本試驗檢測了各組大鼠血清炎癥因子表達水平，結(jié)果顯示，雪蓮果提取物顯著減少血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥細胞因子的表達水平。此外，我們檢測了大鼠肝臟組織中重要抗氧化應(yīng)激的Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)基因的表達水平，結(jié)果顯示，雪蓮果提取物能夠顯著提高Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC的表達水平。因此，本試驗結(jié)果顯示，雪蓮果可能通過激活Nrf2基因，促進抗氧化因子的表達，增強CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠抗氧化能力，進而緩解急性肝損傷。由此可見，雪蓮果改善肝損傷的作用機制可能與其含有的有效成分相關(guān)，復(fù)雜的成分為其改善肝損傷奠定了基礎(chǔ)。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC及pro-caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物，當NLRP3炎癥小體被激活后，前體Caspase-1被切割成具有活性的Caspase-1，Caspase-1切割前體IL-1β（pro-IL-1β），產(chǎn)生具有炎性作用的IL-1β，參與炎癥反應(yīng)［24］。研究表明，CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷肝組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達上調(diào)，這表明NLRP3活化促進Caspase-1、IL-1β參與了CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷，進而抑制Caspase-1、IL-1β等表達并顯著減輕肝臟損傷［25］。研究表明，綠原酸能夠抑制NLRP3炎癥小體激活來保護急性腎損傷［26］。此外，綠原酸可以通過Nrf2/NLRP3信號減弱LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞的炎癥［27］。本研究結(jié)果表明，雪蓮果提取物能夠抑制NLRP3炎癥小體激活，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β等蛋白的表達水平，從而有效改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。

綜上所述，本研究初步確定雪蓮果提取物對CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷具有一定的保護作用，其主要通過降低脂質(zhì)過氧化，清除大鼠體內(nèi)自由基，保護大鼠肝細胞的完整性，同時激活Nrf2的表達，抑制NLRP3炎癥小體激活，降低炎癥反應(yīng)，減輕大鼠肝細胞損傷來保護大鼠肝臟。本研究明確了Nrf2/HO-1/NLRP3通路在雪蓮果提取物治療CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷的作用機制，為雪蓮果的臨床應(yīng)用和市場推廣提供了理論基礎(chǔ)。

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