槲皮素阻滯JAK2/STAT3信號通路對軟骨肉瘤細胞遷移、侵襲和EMT的抑制作用研究

李毅 張恒 趙維彪

摘 要：為探究槲皮素對人軟骨肉瘤細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化（EMT）的影響及對Janus激酶2/信號轉導和轉錄啟動因子3（JAK2/STAT3）信號通路的調控作用，體外培養人軟骨肉瘤SW-1353細胞，用不同濃度槲皮素干預SW-1353細胞24 h，細胞計數試劑盒（CCK-8）法篩選出最適濃度（50.0 μmol/L）槲皮素進行后續試驗。將細胞分為對照組（不做干預）、槲皮素組（50.0 μmol/L槲皮素）、陽性藥物組（6.0 μmol/L阿霉素）、抑制劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋50.0 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制劑AG490）和激活劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活劑colivelin），干預24 h后，用倒置顯微鏡、Transwell小室及Western blot法對細胞形態、遷移、侵襲及JAK2/STAT3通路和EMT相關蛋白的表達水平進行分析。試驗結果顯示：CCK-8法確定槲皮素最適作用濃度為50.0 μmol/L；與對照組比較，槲皮素組和陽性藥物組細胞生長受到抑制，細胞遷移數、侵襲數、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（FN）、p-JAK2和p-STAT3表達水平降低（P<0.05），E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達水平升高（P<0.05）；與槲皮素組相比，抑制劑組上述指標變化趨勢更為顯著（P<0.05），激活劑組則扭轉了這些指標的變化（P<0.05）。槲皮素可抑制人軟骨肉瘤SW-1353細胞的生長、遷移、侵襲和EMT進程，其作用機制可能與阻滯JAK2/STAT3信號通路相關。

關鍵詞：軟骨肉瘤；槲皮素；JAK2/STAT3信號通路；遷移；侵襲

中圖分類號：Q811.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.007

Effect of Quercetin on Chondrosarcoma Cell Migration， Invasion and EMT by Blocking JAK2/STAT3 Signaling Pathway

LI Yi1， ZHANG Heng2， ZHAO Weibiao1*

（1. Department of Orthopedics， Liaoning Jinqiu Hospital， Shenyang 110016， China; 2. Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of China Medical University， Shenyang 110001， China）

Abstract： To investigate the effects of quercetin on human chondrosarcoma cell migration， invasion and epithelial interstitial transformation （EMT） and the regulatory role of Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3 （JAK2/STAT3） signaling pathway， human chondrosarcoma SW-1353 cells were cultured in vitro and treated with quercetin of different concentrations for 24 h. The optimal concentration of quercetin （50.0 μmol/L） was selected by cell counting kit （CCK-8） for subsequent experiments. The cells were divided into control group with no intervention， quercetin group with 50.0 μmol/L quercetin， positive control group with 6.0 μmol/L adriamycin， inhibitor group involving 50.0 μmol/L quercetin +50.0 μmol/L JAK2/STAT3 pathway inhibitor AG490， and activator group involving 50.0 μmol/L quercetin +0.5 μmol/L JAK2/STAT3 pathway activator colivelin. After 24 h of intervention， cell morphology， migration， invasion， and expression levels of JAK2/STAT3 pathway and EMT-related proteins were analyzed by inverted microscope， Transwell chamber and Western blot. The experimental results showed that the optimum concentration of quercetin was determined by CCK-8 method to be 50.0 μmol/L. Compared with the control group， the growth of quercetin group were positive control group were inhibited， the cell migration number， invasion number， expression levels of N-cadherin， Vimentin， fibronectin （FN）， p-JAK2 and p-STAT3 in quercetin group and positive control group decreased （P<0.05）， E-cadherin expression level increased （P<0.05）; compared with quercetin group， the change trend of the above indexes in inhibitor group was more significant （P<0.05）， while the change of these indexes in activator group was reversed （P<0.05）. Quercetin can inhibit the growth， migration， invasion and EMT progression of human chondrosarcoma SW-1353 cells， possibly by blocking the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Key words： chondrosarcoma; quercetin; JAK2/STAT3 signaling pathway; migration; invasion

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 240-246）

軟骨肉瘤（chondrosarcoma）是起源于軟骨細胞的惡性骨腫瘤之一，其最常見的癥狀是局部性疼痛［1］。軟骨肉瘤對放、化療不敏感，耐藥性強，通常采用手術廣泛切除，但手術預后較差、極易復發［2-3］。因此，迫切需要尋找敏感性強、效價高、副作用低的抗腫瘤藥物以治療軟骨肉瘤，而中醫藥在傳統醫學里已發展兩千多年，有很多關于中藥治療軟骨肉瘤的研究［4］。槲皮素（quercetin）是一種廣泛存在于蔬菜和水果中的黃酮類化合物，具有降三高、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎、對神經和心臟有保護作用等多種特性［5-6］，而且還具有抗腫瘤活性［7］。有多項研究報道，槲皮素可以抑制卵巢癌［8］、前列腺癌［9］及骨肉瘤［10］等多種腫瘤細胞的侵襲和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。但槲皮素對軟骨肉瘤細胞的抗腫瘤機制仍不十分明確，基于此，本研究利用槲皮素干預對軟骨肉瘤細胞的遷移、侵襲和EMT的作用機制做進一步的探討，以期為槲皮素開發成腫瘤治療新藥提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人軟骨肉瘤SW-1353細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司；槲皮素、阿霉素（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），Janus激酶2/信號轉導和轉錄啟動因子3（Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3，JAK2/STAT3）通路抑制劑AG490、激活劑colivelin（上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美國Gibco公司），L-15培養基、RIPA裂解液、細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（艾美捷科技有限公司），結晶紫染色液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，基質膠（美國ABC公司），JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（fibronectin，FN）與β-actin一抗、二抗包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標記的羊抗鼠IgG（H+G）和AP標記的羊抗兔IgG（H+G）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）均來源于武漢三鷹生物技術有限公司。DXS_3型倒置熒光顯微鏡購自上海締倫光學儀器有限公司，THZ-98A型二氧化碳培養箱購自上海博迅實業有限公司，Infinite F200型Spark多功能酶標儀購自帝肯（上海）貿易有限公司，GelDoc2000型凝膠成像系統購自美國Backman公司等。

1.2 方法

1.2.1 人軟骨肉瘤SW-1353細胞培養

人軟骨肉瘤SW-1353細胞生長于L-15培養基（含10% FBS、1×青-鏈霉素）中，并置于37℃、100%空氣培養箱中培養，取對數生長期SW-1353細胞用于試驗。

1.2.2 分組及給藥

用不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L）槲皮素干預SW-1353細胞24 h，對照組細胞不做干預，CCK-8法篩選出最適濃度（50.0 μmol/L）進行后續試驗。再將細胞分為對照組（不做干預）、槲皮素組（50.0 μmol/L槲皮素）、陽性藥物組（6.0 μmol/L阿霉素［11］）、抑制劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋50.0 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制劑AG490［12］聯合干預）和激活劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活劑colivelin［13］聯合干預），干預24 h，每個試驗重復3次，并設3個復孔。

1.2.3 CCK-8法測定人軟骨肉瘤SW-1353細胞活性

細胞分組與給藥方法同1.2.2，將對數期生長的細胞胰酶消化后用完全細胞培養液重懸，細胞傳代并以5×103個/孔的密度鋪于96孔板中。以不加細胞只加培養基的孔為空白組，藥物處理24 h和48 h后，各孔加入體積分數為10% 的CCK-8溶液，孵育2 h后，檢測各孔在450 nm的吸光度（optical density，OD）值。細胞活力/%=［（OD不同濃度槲皮素組－OD空白組）/（OD對照組－OD空白組）］×100%。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察人軟骨肉瘤SW-1353細胞的形態

細胞分組與給藥方法同1.2.2，在倒置顯微鏡下記錄細胞形態。

1.2.5 Transwell小室法測定SW-1353細胞的遷移和侵襲能力

細胞分組及干預同1.2.2，各組細胞在藥物干預24 h后，重懸在無血清的完全培養基中，并將1×105個細胞接種到Transwell小室的腔室中，Transwell小室和24孔板之間的腔室中加入500 μL含10% FBS的完全培養基。細胞在37℃中繼續培養24 h，小室下表面的細胞與4%組織細胞固定液室溫孵育15 min，再與1%結晶紫染色液室溫孵育20 min。在侵襲能力分析試驗時，小室提前用基質膠預處理，其他步驟相同。顯微鏡下記錄采集圖像；Image-J圖像分析細胞遷移或侵襲數。

1.2.6 Western blot法檢測SW-1353細胞中蛋白的表達水平

細胞分組與給藥方法同1.2.2，收集各組細胞，并將細胞懸浮在預冷的放射免疫沉淀分析法（radio immuno precipitation assay，RIPA）裂解液中30 min，12 000 r/min冷凍離心10 min后收集上清液。目的蛋白先用凝膠電泳進行分離，后經聚偏二氟乙烯膜轉印電泳、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膜顯色。在凝膠成像系統上采集蛋白條帶并用系統配備的分析軟件進行蛋白灰度值分析，以β-actin為內參。蛋白相對表達水平為目標蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.3 統計學分析

數據分析在SPSS 24.0軟件上進行，符合正態分布的數據表示為平均數±標準差（x±s），數據分析多組間采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用Students t檢驗。P<0.05代表具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 槲皮素干預SW-1353細胞的作用濃度篩選

CCK-8法檢測槲皮素對SW-1353細胞活力的影響（圖1），結果顯示：干預24 h時，與對照組相比，隨著槲皮素作用濃度增加，細胞活力逐漸降低，其中12.5 μmol/L槲皮素組差異無統計學意義（P>0.05），25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L槲皮素組差異有統計學意義（P<0.05），100.0和200.0 μmol/L槲皮素細胞活力低于半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）；干預48 h時，細胞降低趨勢與干預24 h相似，25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L槲皮素均顯著降低（P<0.05）。為了排除細胞活力對SW-1353細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究選擇了干預時間較短（24 h）、細胞活力顯著降低且相較于IC50稍高的槲皮素濃度（50.0 μmol/L）。

2.2 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353細胞的生長

利用倒置顯微鏡觀察了各組SW-1353細胞形態的變化發現，與對照組比較，槲皮素組、陽性藥物組、抑制劑組細胞的生長受到抑制，激活劑組細胞生長抑制作用不明顯，與槲皮素組相比，抑制劑組細胞生長抑制作用明顯，具體情況見圖2。

2.3 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353細胞的遷移

Transwell小室測定細胞的遷移能力顯示，干預24 h，槲皮素組和陽性藥物組遷移細胞數較對照組下調（P<0.05），抑制劑組遷移細胞數明顯低于槲皮素組（P<0.05），激活劑組細胞遷移數明顯高于槲皮素組（P<0.05），具體情況見圖3。

2.4 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353細胞的侵襲

Transwell小室測定細胞的侵襲能力顯示（圖4），干預24 h，槲皮素組和陽性藥物組侵襲細胞數均顯著低于對照組（P<0.05），侵襲細胞數在抑制劑組明顯低于槲皮素組（P<0.05），在激活劑組明顯高于槲皮素組（P<0.05）。

2.5 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353的EMT進程

與對照組相比，E-cadherin蛋白表達水平在槲皮素組和陽性藥物組上調，N-cadherin、Vimentin和FN三個蛋白水平在槲皮素組和陽性藥物組下調（P<0.05）；較槲皮素組，E-cadherin蛋白水平在抑制劑組較高，在激活劑組較低，N-cadherin、Vimentin和FN在抑制劑組較低，在激活劑組較高（P<0.05），具體情況見圖5。

2.6 槲皮素抑制SW-1353細胞中JAK2/STAT3信號通路的活化狀態

為了研究槲皮素對JAK2/STAT3信號通路活化狀態的影響，檢測了該通路的關鍵性蛋白JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3的表達水平（圖6a），蛋白定量分析結果顯示（圖6b）：各組之間JAK2和STAT3蛋白的表達水平無顯著差異（P>0.05）；與對照組相比，槲皮素組和陽性藥物組細胞p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達水平顯著降低（P<0.05），與槲皮素組相比，抑制劑組p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達水平顯著降低（P<0.05），激活劑組p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05）。

3 討論

軟骨肉瘤作為原發惡性骨腫瘤，多發生在股骨和骨盆等身體部位，早中期臨床癥狀并不明顯，大多患者發現時已發生轉移，手術廣泛切除對患者肢體功能具有嚴重的不良影響，且術后預后差、易復發［14］，因此，研究軟骨肉瘤細胞的轉移，對于患者治療具有非常重要的臨床意義。近幾年，越來越多的醫學研究傾向于開發防治腫瘤侵襲及轉移相關的中醫藥物。中醫學對骨腫瘤病因病機的認識，有“腎主骨”之說，故認為骨腫瘤的發生與腎精虧損、骨髓空虛有關，用中藥治療骨腫瘤能夠起到清熱解毒、驅邪扶正之功效［15］。槲皮素是植物中廣泛分布的一種黃酮醇類化合物，毒副作用小，具有多靶點和不易耐藥的優勢，能夠與其他藥物協同發揮抗腫瘤作用［16］，近年來在前列腺癌［17］、乳腺癌［18］及食管癌［19］等細胞中被報道有抗癌作用。在骨肉瘤細胞的研究中，槲皮素對腫瘤細胞的抑制作用已有相關報道［20］，其抗腫瘤機制涉及細胞的遷移和侵襲等方面。本試驗發現，槲皮素處理后，SW-1353細胞活力降低。為排除細胞活力對細胞遷移侵襲的影響，本研究選擇對細胞活力有顯著影響且濃度較低（50.0 μmol/L）的槲皮素進行試驗，發現50.0 μmol/L槲皮素和6.0 μmol/L阿霉素對SW-1353細胞有相同的作用效果，均可抑制人軟骨肉瘤細胞SW-1353的生長、遷移和侵襲能力，證明了槲皮素可以抑制軟骨肉瘤細胞，有良好的醫學應用前景。

JAK2/STAT3信號通路與腫瘤細胞周期、發生發展和耐藥性等相關［21］。有研究報道，二氫楊梅素可通過調控JAK2/STAT3信號通路抑制人骨肉瘤MG-63細胞活性、侵襲和遷移能力［22］。槲皮素可阻斷JAK/STAT通路抑制人宮頸癌C-33A細胞增殖并誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期等［23］，但槲皮素對軟骨肉瘤細胞的作用機制并不明確。本文檢測JAK2/STAT3通路關鍵蛋白結果顯示，槲皮素組較對照組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平降低，表明槲皮素可以抑制JAK2/STAT3通路。惡性腫瘤的特點除了生長速度較快之外，常伴隨著侵襲、浸潤轉移等過程。作為惡性腫瘤預后的主要影響因素，侵襲與轉移的發生與EMT密切相關［24］。在EMT生物學過程中，上皮細胞失去極性，細胞黏性降低，遷移和侵襲能力增強是發生腫瘤擴散的一個重要因素［25］。移志剛［26］發現，RIPK4抗軟骨肉瘤作用與抑制EMT進程有關。本研究證實槲皮素對SW-1353細胞有抑制生長、遷移和侵襲作用后，發現槲皮素可抑制軟骨肉瘤細胞的EMT進程。為了研究相關的作用機制，本研究加入了JAK2/STAT3通路抑制劑AG490和激活劑colivelin，發現與槲皮素組相比，抑制劑組抑制了SW-1353細胞的遷移及侵襲能力，增加了E-cadherin表達，降低了N-cadherin、Vimentin、FN及p-JAK2和p-STAT3表達水平，激活劑組結果與抑制劑組相反，提示槲皮素可能是通過JAK2/STAT3通路去調節SW-1353細胞的遷移、侵襲和EMT進程的。這與Wu等［27］在肝細胞癌LM3細胞中發現槲皮素通過消除JAK2/STAT3信號通路發揮抗腫瘤作用，以及與鄭巖松等［28］發現的槲皮素在人肝癌SMMC-7721細胞中抑制EMT的進程結果相符。

綜上所述，槲皮素可通過抑制JAK2/STAT3信號通路抑制人軟骨肉瘤SW-1353細胞的遷移、侵襲和EMT進程，為軟骨肉瘤靶向治療提供新方向。但槲皮素對軟骨肉瘤其他生物學特性的影響及相關分子機制仍需進一步研究。

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