丹參葛根提取物對阿霉素引發小鼠心力衰竭的作用

［摘要］ 目的

探究丹參葛根提取物（DG）對阿霉素（DOX）引發的心力衰竭小鼠（DOX-HF小鼠）的心臟保護作用。

方法 將32只6周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、低劑量給藥組（C組）和高劑量給藥組（D組），每組8只。B組、C組和D組腹腔注射DOX 4周（每周5 mg/kg），C組和D組在建模開始時每日1次灌胃DG水溶液，灌胃劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg；A組、B組每日灌胃相同劑量的生理鹽水。采用超聲心動圖檢測評估心臟機械功能改變情況，蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色觀察心肌組織病理學變化，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、肌鈣蛋白I（cTnI）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）水平。

結果 超聲心動圖檢測結果顯示，與A組相比，B組左室射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）顯著下降，左室舒張末期容積（LVEDV）和左室收縮末期容積（LVESV）顯著升高；與B組相比，C組和D組EF和FS顯著升高，LVEDV和LVESV顯著下降，差異均有顯著性（F=7.66～29.30，Plt;0.05）。HE染色結果顯示，與A組相比，B組心肌組織結構明顯異常，心肌細胞排列紊亂且水腫，空泡化嚴重；C組和D組心肌細胞排列輕度紊亂，可見少許空泡。Masson染色結果顯示，與A組相比，B組膠原沉積顯著增加，C組和D組膠原沉積較B組明顯減少。ELISA檢測顯示，與A組比較，B組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平顯著升高，C組和D組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平較B組顯著下降，差異有顯著性（F=17.54～32.59，Plt;0.05）。

結論 DG能夠有效保護DOX-HF小鼠的心臟功能。

［關鍵詞］ 多柔比星；心力衰竭；丹參葛根提取物；炎癥

［中圖分類號］ R969

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0894-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.202

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240104.1606.003;2024-01-08 11：04：52

EFFECT OF SALVIA MILTIORRHIZA AND RADIX PUERARIAE EXTRACT ON DOXORUBICIN-INDUCED HEART FAILURE IN MICE

ZHANG Mengyao， ZHANG Mi， HAN Yantao， ZHAO Wenwen

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the cardioprotective effect of Salvia miltiorrhiza-Radix puerariae extract （DG） on mice with heart failure induced by doxorubicin （DOX-HF mice）.

MethodsIn the experiment， 32 C57BL/6J mice （6 weeks old， male） were randomly divided into four groups： control group （group A）， model group （group B）， low-dose DG group （group C）， and high-dose DG group （group D） （n=8 per group）. Mice form groups B， C， and D received an intraperitoneal injection of DOX for 4 weeks （5 mg/kg per week）. Meanwhile， mice in groups C and D were intragastrically given DG water solution once daily at the beginning of modeling with doses of 50 and 100 mg/kg， respectively. Mice in groups A and B were intragastrically given the same dose of normal saline daily. The changes in cardiac mechanical function were evaluated by echocardiography; myocardial histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin （HE） staining and Masson staining; enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure levels of serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP）， cardiac troponin I （cTnI）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and interleukin-6 （IL-6）.

ResultsEchocardiography data showed that compared with group A， group B had significantly decreased left ventricular ejection fraction and left ventricular fractional shortening and significantly increased left ventricular end-diastolic volume and left ventricular end-systolic volume. Above phenomena that occurred in group B were significantly reversed in groups C and D （F=7.66-29.30，Plt;0.05）. Furthermore， the data from HE staining showed that significantly abnormal myocardial tissue structure characterized by disordered and edematous myocardial cells especially with se-

rious vacuolation was observed in group B compared with group A. Meanwhile， above morphological changes were alle-

viated with DG treatment in mice from groups C and D. Besides， the data from Masson staining showed that collagen deposition was significantly increased in group B compared with group A but was significantly reduced in groups C and D compared with group B. Additionally， ELISA data showed that compared with group A， group B had significantly increased levels of serum NT-proBNP， cTnI， TNF-α， and IL-6， while these cytokines were significantly decreased in mice from groups C and D compared with those from group B （F=17.54-32.59，Plt;0.05）.

ConclusionDG presents

a cardioprotective effect on DOX-HF mice.

［KEY WORDS］doxorubicin; heart failure; Salvia miltiorrhiza-Radix pueraria extract; inflammation

中國的心血管疾病和癌癥發病率處于較高水平，且隨著長期使用抗腫瘤藥物，其引發的心血管并發癥是多數病人死亡的重要原因，其中心力衰竭（HF）是主要的并發癥之一［1-3］。防治抗腫瘤誘發的HF是現階段面臨的棘手問題。HF是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的一組復雜臨床綜合征［4-6］。丹參葛根提取物（DG）源自《施今墨對藥》，丹參功效活血祛瘀，化瘀生新，鎮靜安神；葛根輕揚升發，解肌退熱；兩者合用，氣血同治，相輔相成［7］。本研究通過建立阿霉素（DOX）誘導的HF（DOX-HF）小鼠模型，探究DG對DOX-HF小鼠的心臟保護作用，為DG應用于抗腫瘤治療誘發的心臟病的臨床治療提供參考。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠32只，體質量20～25 g，購買于濟南朋悅實驗動物育種有限公司，飼養于青島大學動物實驗中心，室溫（22±2）℃，濕度（60±5）%，光照/黑暗周期為12 h，

自由飲水和進食。

1.1.2 儀器及試劑 DG購買于南通經緯生物科技有限公司；DOX購自美國MCE公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒和Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、肌鈣蛋白I（cTnI）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；小動物超聲系統（中國維勝中國有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DOX-HF小鼠模型的制備以及實驗分組

C57BL/6J小鼠適應性喂養1周后，隨機分為4組，每組8只，分別為對照組（A組）、模型組（B組）、低劑量給藥組（C組）、高劑量給藥組（D組）。B組、C組和D組連續4周腹腔注射DOX建立HF小鼠模型，注射劑量為每周5 mg/kg，累計劑量為20 mg/kg，A組不做處理。C組和D組在建模初始時每日灌胃給予DG提取液，灌胃劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg；A組和B組在建模初始時每日灌胃給予同等劑量的生理鹽水。

1.2.2 超聲心動圖檢查 腹腔注射5 g/L戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉小鼠，采用配備MS400探頭（18～38 MHz）的Vevo 2100成像系統獲得心臟超聲心動圖，檢測左室射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）、左室收縮末期容積（LVESV）和左室舒張末期容積（LVEDV）。

1.2.3 樣本采集及處理 末次灌胃結束后，禁食12 h，眼球取血，室溫靜置30 min，4 500 r/min離心15 min，吸取血清，用于生化指標檢測。取心臟組織并迅速置于40 g/L多聚甲醛中固定48 h。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色 心臟組織固定后，常規石蠟包埋、切片，厚度為5 μm。應用HE染色試劑盒染色，按照說明書操作。顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理學變化。

1.2.5 Masson染色 應用Masson染色試劑盒，操作嚴格按照說明書方法進行，顯微鏡下觀察各組小鼠心肌纖維化情況。

1.2.6 血清中NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平檢測 將血清樣本從-80 ℃冰箱中取出，平衡至室溫，采用ELISA檢測試劑盒檢測各指標水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學分析

采用Graphpad prism 5.0軟件進行統計學分析。計量資料結果以±s形式表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey法。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 各組小鼠超聲心動圖檢測結果比較

各組小鼠EF、FS、LVEDV和LVESV比較差異均有顯著性（F=7.66～29.30，Plt;0.05）。兩兩比較顯示，與A組相比，B組小鼠EF和FS顯著下降，LVEDV和LVESV則顯著升高（Plt;0.05），提示DOX-HF小鼠造模成功。與B組相比，C組和D組小鼠的EF和FS顯著升高，LVEDV和LVESV顯著下降并趨近于對照組（Plt;0.05）；C組和D組EF、FS、LVEDV和LVESV差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠心肌組織病理學變化

HE染色顯示，A組心肌細胞排列規整，未觀察到明顯異常病理學改變；B組心肌組織結構明顯異常，心肌細胞排列紊亂、水腫、空泡化嚴重；C組和D組心肌細胞排列輕度紊亂，可見少許空泡（圖1）。

2.3 各組小鼠心肌纖維化比較

Masson染色結果顯示，A組存在極少的膠原沉積，心肌間質纖維化不明顯；B組膠原沉積顯著增加，表明心肌間質纖維化嚴重；與B組相比，C組和D組藍色膠原沉積明顯減少（圖2）。

2.4 各組小鼠血清NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平比較

各組小鼠血清NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平比較差異均有顯著性（F=17.54～32.59，Plt;0.05）。與A組相比，B組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平顯著升高（Plt;0.05），C組和D組的IL-6水平顯著升高（Plt;0.05）。與B組比較，C組和D組NT-proBNP、cTnI、TNF-α和IL-6水平顯著下降（Plt;0.05）。見表2。

3 討" 論

HF是由于心臟結構和功能異常導致泵功能失代償的一種復雜臨床綜合征［8］，已成為一個嚴重的臨床和公共衛生問題［9］。近幾十年來，隨著腫瘤病人的急劇增加，以DOX為代表的蒽環類藥物廣泛應用，在癌癥治療過程中對病人產生嚴重心臟毒性限制了其進一步應用［10-11］。因此，尋求有效防治蒽環類藥物引發HF的治療方法尤為重要。

DG應用始見于《施今墨對藥》，是經典的活血化瘀配伍藥對，已被證明具有良好的心血管保護作用［12-13］。本研究通過建立DOX-HF小鼠模型探究了DG對DOX-HF的保護作用，超聲心動圖檢測顯示，DG可以顯著提高DOX-HF小鼠心臟機械功能，相較于低劑量組，高劑量組小鼠的EF和FS有所降低，LVESV和LVEDV有所升高，更趨近于對照組小鼠，但差異無統計學意義，并不能證明DG治療具有濃度依賴性。心肌細胞肥大、排列紊亂，心肌組織纖維化是HF主要病理表現［14-15］。本研究結果顯示，DG能夠明顯改善心肌細胞排列紊亂和細胞水腫，降低心肌組織纖維化水平。

NT-proBNP和cTnI是典型的HF診斷生物標志物，被廣泛用于HF的預測和早期診斷［16-17］。本研究聯合檢測血清NT-proBNP和cTnI水平，探究DG對DOX-HF的改善作用，結果顯示DG可以顯著降低血清NT-proBNP和cTnI水平。

炎癥反應是DOX引發心臟毒性的主要機制，長期慢性炎癥會加速心肌纖維化以及HF進程。TNF-α能夠誘導活性氧生成，誘導心肌細胞凋亡；此外，大量的TNF-α通過激活中性神經磷脂酶，介導一氧化氮合成來抑制心肌收縮力［18］。IL-6可以通過刺激GP130-STAT3信號通路促進心肌肥大［19］，IL-6還可以促進膠原沉積加速心室重構［20］。本研究發現，DG可以顯著降低DOX-HF小鼠的機體炎癥反應，提示DG可以通過降低機體炎癥反應來改善HF。

綜上所述，DG能夠降低DOX-HF小鼠模型炎癥反應和心肌損傷標志物水平，改善心臟機械功能。本文研究可為抗腫瘤治療誘發的心臟病的臨床治療提供參考。

［參考文獻］

［1］XIA C F， DONG X S， LI H， et al. Cancer statistics in China and United States， 2022： profiles， trends， and determinants［J］." Chinese Medical Journal， 2022，135（5）：584-590.

［2］ZHAO D， LIU J， WANG M， et al. Epidemiology of cardiovascular disease in China： current features and implications［J］." Nature Reviews Cardiology， 2019，16（4）：203-212.

［3］LYON A R. Heart failure resulting from cancer treatment： still serious but an opportunity for prevention［J］." Heart （British Cardiac Society）， 2019，105（1）：6-8.

［4］ZHAO D S， ZHONG G H， LI J W， et al. Targeting E3 ubi-

quitin ligase WWP1 prevents cardiac hypertrophy through destabilizing DVL2 via inhibition of K27-linked ubiquitination［J］." Circulation， 2021，144（9）：694-711.

［5］MASTIKHINA O， MOON B U， WILLIAMS K， et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing［J］." Biomaterials， 2020，233：119741.

［6］HABIMANA O， MODUPE SALAMI O， PENG J F， et al. Therapeutic implications of targeting pyroptosis in Cardiac-related etiology of heart failure［J］." Biochemical Pharmacology， 2022，204：115235.

［7］孫小鑫，苗青，王瑞海，等. 丹參-葛根藥對成分、藥理及臨床應用的研究進展［J］." 世界科學技術（中醫藥現代化）， 2020，22（12）：4308-4313.

［8］CHEN J， ARONOWITZ P. Congestive heart failure［J］." The Medical Clinics of North America， 2022，106（3）：447-458.

［9］ROGER V L. Epidemiology of heart failure： a contemporary perspective［J］." Circulation Research， 2021，128（10）：1421-1434.

［10］SHEIBANI M， AZIZI Y， SHAYAN M， et al. Doxorubicin-induced cardiotoxicity： an overview on pre-clinical therapeutic approaches［J］." Cardiovascular Toxicology， 2022，22（4）：292-310.

［11］CHRISTIDI E， BRUNHAM L R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］." Cell Death amp; Disease， 2021，12（4）：339.

［12］KOON C M， WING-SHING CHEUNG D， WONG P H， et al. Salviae miltiorrhizae radix and puerariae lobatae radix her-

bal formula improves circulation， vascularization and gait function in a peripheral arterial disease rat model［J］." Journal of Ethnopharmacology， 2021，264：113235.

［13］ZHAI S， ZHANG X F， LU F， et al. Chinese medicine GeGen-DanShen extract protects from myocardial ischemic injury through promoting angiogenesis via up-regulation of VEGF/VEGFR2 signaling pathway［J］." Journal of Ethnopharmacology， 2021，267：113475.

［14］MOURAD O， YEE R， LI M Y， et al. Modeling heart diseases on a chip： advantages and future opportunities［J］." Circulation Research， 2023，132（4）：483-497.

［15］LIU J Y， LI W， DENG K Q， et al. The E3 ligase TRIM16 is a key suppressor of pathological cardiac hypertrophy［J］." Circulation Research， 2022，130（10）：1586-1600.

［16］PAN Y S， LI D J， MA J， et al. NT-proBNP test with improved accuracy for the diagnosis of chronic heart failure［J］." Medicine， 2017，96（51）： e9181.

［17］WANG X Y， ZHANG F， ZHANG C， et al. The biomarkers for acute myocardial infarction and heart failure［J］." BioMed Research International， 2020，2020：1-14.

［18］SCHUMACHER S M， NAGA PRASAD S V. Tumor necrosis factor-α in heart failure： an updated review［J］. Current Car-

diology Reports， 2018，20（11）：1-11.

［19］HUO S Q， SHI W， MA H Y， et al. Alleviation of inflammation and oxidative stress in pressure overload-induced cardiac remodeling and heart failure via IL-6/STAT3 inhibition by raloxifene［J］." Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2021，2021：6699054.

［20］MARKOUSIS-MAVROGENIS G， TROMP J， OUWER-

KERK W， et al. The clinical significance of interleukin-6 in heart failure： Results from the BIOSTAT-CHF study［J］." European Journal of Heart Failure， 2019，21（8）：965-973.

（本文編輯 黃建鄉）