當歸治療乳腺癌網絡藥理學機制研究

摘 要：運用網絡藥理學探討當歸治療乳腺癌的作用機制。運用中藥藥理學數據庫（TCMSP）設定藥物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，篩選出當歸125種活性成分，通過GeneCards、OMIM 等數據庫查尋乳腺癌基因。使用Cytoscape軟件構建當歸治療乳腺癌的“成分-靶標-疾病”網絡圖，將關鍵核心靶點導入STRING庫，繪制蛋白質互作（PP2）網絡圖，對PPI可視化分析。對核心靶點進行GO、KEGG分析，探究當歸治療乳腺癌的物質基礎及作用機制。篩選出當歸主要有效活性成分2個，作用于40個靶標，GO功能富集提示的生物學過程及功能集中在G蛋白偶聯胺受體活性（9個蛋白）、突觸后神經遞質受體活性（7個蛋白）、神經遞質受體活性（7個蛋白）、被動跨膜轉運蛋白活性（7個蛋白）等。KEGG分析揭示當歸治療本病主要以Ca信號、p53信號、Estrogen信號等通路為主。通過本次研究可探討當歸治療乳腺癌的機制，為新藥等研發提供依據。

關鍵詞：當歸；乳腺癌；網絡藥理；有效成分；靶點

中圖分類號：R258

全球乳腺癌（HCC）是婦科疾病中最常見、最多發的惡性腫瘤之一[1]，目前根據美國癌癥協會2019年相關統計，美國女性乳腺癌的新發病例在其他癌癥類型中位居首位[2]。生活節奏的加快、生活方式的改變，以及生活壓力的增大，導致中國乳腺癌的發病率逐年呈增高態勢[3]。隨著臨床上針對乳腺癌手術、化療、內分泌等多種診療模式的高速發展，該病死亡率已逐年遞減，但2020年全球范圍女性因乳腺癌死亡的病人大約有69萬人[4]。現代醫家將“乳石癰”“乳巖”“奶巖”等中醫病名歸乳腺癌范疇內，其病位涉及的臟腑主要為肝、脾、腎。乳腺癌的主要病機是氣滯血瘀痰凝，機體的氣血運行不暢，氣血瘀滯最終形成“瘤”[5-6]。尋找高效低毒的藥物是科研人員亟須解決的熱點問題。

當歸首載《神農本草經》，是傘形科屬植物當歸 Angelica sinensis（Oliv.）Diel 的干燥根[7]，主產甘肅。秋末采挖，采挖后去除泥沙和根須，捆成小把，用煙火緩緩熏干，切成片，生用或酒炙。藥性：甘、辛、溫。歸肝、心、脾經。補血活血，調經止痛，潤腸通便。現代研究發現，多糖為當歸的主要有效成分，主要包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖等糖類，當歸多糖可抑制腫瘤生長，增加機體巨噬細胞的數目、增強機體的吞噬功能[8]。

網絡藥理學是現代新發展起來專門研究中藥藥理的熱門領域，整合了現代系統生物學和中藥藥理學，以促進中藥以發現、開發和治療疾病機制的研究[9]。基于該研究可反映中藥化合物與疾病靶點之間的相互作用[10]，如治療疾病機制闡釋，中藥藥理作用的預測和潛在成分的篩選等[11]。該研究將中藥中各化合物與疾病的相互作用網絡集合生成網絡圖[12]，促使我們更直觀地發現中藥和疾病之間的相互作用，也促使我們從宏觀的角度理解中藥，為研究中藥復雜的作用機制提供了新思路和新方法[13]。因此，本研究對當歸的有效化學成分進行分析，更科學、更深層次的闡釋了當歸治療乳腺癌的作用機制，為進一步探索當歸治療乳腺癌的作用機制奠定基礎[14]。

1 資料與方法

1.1 當歸活性成分篩選

運用中藥藥理學數據庫（TCMSP）[15]（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“當歸”為關鍵檢索詞，檢索到當歸全部有效活性化學成分，依據藥物口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）值≥0.18[16]，進一步篩選出當歸中DL和OB較好的優效化合物。

1.2 當歸成分獲取與收集

將得到的“當歸”主要活性成分，導入Perl軟件校正，校正當歸靶點的名稱，構建主要有效活性成分的靶點庫。

1.3 乳腺癌靶點構建

通過在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM（http：/ /www.omim.org/）[17]，GeneCards （https：//www.genecards.org/）[18]查找該疾病的靶點，將收集好的靶點整理，使用R語言進行分析，先將Venny包導入R語言中，將藥物主要有效活性成分與乳腺癌疾病靶點取交集，獲得當歸治療乳腺癌的核心靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 藥物-靶點-疾病網絡圖的構建

將藥物靶點、成分、疾病基因等導入Cytoscape 3.7.1 軟件（http：//www.cytoscape.org）[19]中，構建出“藥物-靶點-疾病”網絡圖。該圖揭示了藥物-靶點-疾病之間的關聯及相互作用，可進一步探討當歸治療乳腺癌的機制。

1.5 構建蛋白質網絡圖

將當歸治療乳腺癌的核心靶點導入STRING數據庫[20]（https：//string-db.org），繪制分析蛋白質之間的作用。將篩選蛋白質的條件設置“MultipleProteins”“物種”設定為人類（Homo Sapiens），將當歸治療乳腺癌的核心靶點導入STRING系統，設定分值＞0.9，并隱藏游離蛋白質-蛋白質相關作用（PPI）網絡圖之外的點蛋白，得到PPI網絡圖。

1.6 生物功能注釋（GO）及通路分析（KEGG）

將得到的核心靶點運用R語言進行GO注釋和KEGG進行富集分析，得到的結果進行可視化處理。 P＜0.05為篩選條件，分析生物學過程與篩選通路，繪制成氣泡圖并進行可視化處理。

2 結果

2.1 當歸活性成分篩選

通過TCMSP檢索到當歸全部有效有化學成分125個，依據OB≥30%和 DL≥0.18進行篩選，得到主要潛在的有效活性化學成分2個，見表 1。

2.2 當歸治療乳腺癌潛在靶點

當歸主要潛在的有效活性成分2個，利用GeneCards 和OMIM 收集乳腺癌基因靶點，合并剔除重復的靶點。運用R語言安裝“VennDiagram”程序包，將當歸和疾病關鍵靶點取交集，得到當歸治療乳腺癌的核心靶點，并繪制韋恩圖（圖 1）。獲得關鍵核心靶點共用40個。

2.3 當歸治療乳腺癌網絡圖構建

將當歸的化學成分、靶點，疾病基因等導入到Cytoscape軟件中，繪制藥物-靶點-疾病網絡圖（圖2），不同的節點代表不同的意義。

2.4 關鍵靶點PPI網絡圖

將當歸治療乳腺癌的共同核心靶點上傳到在線STRING 蛋白庫中，評分值設置為＞0.9，將PPI游離的單個蛋白予以隱藏，得到PPI 網絡圖（圖 3）。該PPI圖中蛋白節點有40個，邊數為117條，蛋白平均度值為5.85。蛋白邊數越多，揭示該節點對應的相關靶點的地位作用越顯著。通過R語言得到關鍵靶點的條形圖（圖4）。結果揭示ADRA2A、ADRA1B、CASP3、JUN、MAOA等蛋白的度值較其他蛋白高，揭示了這些蛋白在疾病中的作用越顯著，也是和其他蛋白互通的紐帶。

2.5 生物功能及通路分析

在R語言中安裝“clusterProfiler”生物程序包，利用該包Bioconductor 的 GO 注釋信息和 KEGG 庫進行富集分析。GO 揭示當歸治療乳腺癌形成的關鍵靶點，富集顯著的前10個生物學功能主要為G蛋白偶聯胺受體活性（9個蛋白）、突觸后神經遞質受體活性（7個蛋白）、神經遞質受體活性（7個蛋白）、被動跨膜轉運蛋白活性（7個蛋白）、蛋白質異二聚活性（6個蛋白）、金屬離子跨膜轉運蛋白活性（6個蛋白）、G蛋白偶聯神經遞質受體活性（5個蛋白）、乙酰膽堿受體活性（5個蛋白）、泛素蛋白連接酶結合（5個蛋白）、DNA結合轉錄因子結合（5個蛋白）。表明當歸主要潛在有效成分可以通過調控多種生物學途徑而發揮治療乳腺癌的作用（圖5）。

通過KEGG富集分析，按照P值＜0.01篩選出3條通路。結果表明，基因顯著富集在鈣信號通路（8個基因靶點）、p53信號通路（5個基因靶點）、Estrogen信號通路（6個基因靶點），如圖6所示。

3 討論

當歸主要活性成分中β-谷甾醇可通過抑制PI3K/Akt 通路，逆轉上皮-間質之間的轉化，同時誘導乳腺癌細胞的凋亡而抑制其轉移[21]。

研究發現RNA結合域ADAR1對暴露于8-Cl-Ado的乳腺癌細胞細胞生長抑制至關重要。8-Cl-Ado共同抑制細胞增殖，至少通過靶向ADAR1/p53/p21信號通路誘導G1期阻滯和凋亡[22]。研究揭示了Met-和p53介導的信號通路之間的串擾，這些信號通路在基因調控中起著重要作用，具有管腔祖細胞功能。特別是，它表明p53的缺失既不是單獨的，也不是與Met信號結合的激活導致管腔祖細胞中早期可檢測到的細胞命運改變。可以想象，還需要其他活動為管腔源性TNBC賦予基礎特異性特征。這是第一項在乳腺癌外顯體中發現核因子MTA1的研究，證明了MTA1通過外顯體轉移，并表征外顯子MTA1如何影響癌癥信號通路。這項工作表明，外顯子介導的MTA1是乳腺癌的重要驅動力靶向外顯子MTA1信號轉導的進展和機制或活動是乳腺癌潛在的治療策略[23]。在乳腺癌患者中對hnRNPK進行免疫定位，這表明hnRNPKERα陽性癌細胞的免疫反應性顯著較高，而ERα陽性癌細胞的免疫反應性顯著較低，Ki67陽性或增殖性癌細胞。這些結果表明hnRNPK直接相互作用與ERα結合，參與乳腺癌ER介導的信號通路。此外，hnRNPK表達可能是ERα陽性患者內分泌治療的另一個靶點乳腺癌[24]。

總之，乳腺癌的病因多樣、發病機制未闡明、病情變化迅速、病程進展快、治療療效不佳，目前仍是全球性難題。西醫主要以手術、放化療等治療為主，仍存在一定的局限性，當歸以“多成分、多靶點、多通路”的特點在乳腺癌防治方面呈現出獨特優勢。本次研究分析當歸對治療乳腺癌的有效主要活性成分、關鍵核心靶點和主要通路，得到了治療乳腺癌的關鍵核心靶點、生物分子及通路，一方面從微觀方面佐證了當歸治療乳腺癌的作用機制；另一方面本次研究的結果可指導研究者開展實驗研究驗證，為更深層次的闡明當歸治療乳腺癌作用機制奠定了一定的基礎。

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△通信作者：吳紅彥，主任醫師，從事中醫老年病學研究，E-mail：wu.hy@163.com。