山楂提取物對高溫環境下跑臺大鼠T細胞的影響

【摘要】" 目的" 了解山楂提取物干預下高溫運動大鼠T淋巴細胞的變化，探究山楂提取物干預對機體免疫的影響。方法" 24只6w齡雄性SD大鼠，適應性飼養1w后，隨機分為四組，分別為常溫運動對照組、高溫運動模型組、高溫運動補充低劑量山楂提取物組（高溫低劑量組）、高溫運動補充高劑量山楂提取物組（高溫高劑量組）。其中，高溫環境的濕球黑球溫度（wet bulb globe temperature，WBGT）系數為33±2℃，高劑量為156mg/kg，低劑量為78mg/kg。跑臺傾角15°，轉速為14rpm，上、下午各運動30min，每天共1h，共進行4w。每周稱量大鼠體質量。4w后，稱量胸腺、肝臟和脾臟的質量，計算臟器系數；采用流式細胞儀檢測大鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細胞的百分含量并計算CD4＋/CD8＋。結果" 四組大鼠跑臺實驗前體質量比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）；跑臺實驗后四組大鼠體質量差異有統計學意義（Plt;0.05），其中高溫低劑量組大鼠體質量最低，增重最少。四組大鼠胸腺系數、肝臟系數、脾臟系數比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）；兩兩比較顯示，高溫低劑量組大鼠胸腺系數、肝臟系數高于高溫運動組及高溫高劑量組；高溫低劑量組大鼠脾臟系數高于高溫運動組及高溫高劑量組；高溫高劑量組脾臟系數高于高溫運動組，以上差異均有統計學意義（Plt;0.05）。四組大鼠血液T細胞亞群比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），其中高溫高劑量組 CD4＋、CD8＋T淋巴細胞比例最高，CD3＋T淋巴細胞、CD4＋/CD8＋比例較高，表明高溫下攝入高劑量山楂提取物，能夠提高T淋巴細胞各亞群百分含量。結論" 補充山楂提取物可以調節高溫運動條件下大鼠T淋巴細胞各亞群的水平，穩定和改善機體免疫系統。

【關鍵詞】" 山楂提取物；高溫；臟器系數；T淋巴細胞

中圖分類號" R285.5" " 文獻標識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）20--04

【Abstract】" Objective" To study the changes of T lymphocytes of rats undergoing high-temperature exercise under the intervention of hawthorn extract， and investigate the impact of hawthorn extract intervention on immune function of the body. Methods" Twenty-four 6-week-old male SD rats were randomly divided into 4 groups after adaptive feeding for 1 week， which were divided into normal temperature exercise control group， high temperature exercise model group， hawthorn supplement high temperature low dose exercise group， hawthorn supplement high temperature high dose exercise group. Among them， the Wet Bulb Globe Temperature （WBGT） index in a high-temperature environment is 33 ± 2℃. The high dose is 156 mg/kg and the low dose is 78 mg/kg. The running platform has an inclination of 15° and a rotational speed of 14 rpm. Exercise for 30 minutes in the morning and afternoon， a total of 1 hour per day， for a total of 4 weeks. Weigh the body weight of rats every week. After 4 weeks， the weight of thymus， liver and spleen in rats was weighed and the organ index was calculated; The percentage content of blood T lymphocyte subsets CD3+， CD4+， CD8+T lymphocytes in rats was measured by flow cytometry and the CD4+/CD8+was calculated. Results" "The difference between the mass of the four groups （Pgt;0.05） and the four groups （Plt;0.05）， with the high temperature and low dose group had the lowest mass and the least weight gain. The differences between thymus coefficient， liver coefficient and spleen coefficient of the four groups were statistically significant （Plt;0.05）. The ison between the differences showed that high temperature and high temperature dose group exceeded high temperature and high temperature dose group; the differences were statistically significant （Plt;0.05）. The blood T cell subsets of the four groups were statistically significant （Plt;0.05）， in which the high-dose group had the highest proportion of CD3+， CD4+，CD8+ and CD4+/CD8+， indicating that the high-dose hawthorn extract at high temperature could increase the percentage content of each subset of T lymphocytes. Conclusion Supplementing hawthorn extract can regulate the levels of various subsets of T lymphocytes in rats under high-temperature exercise conditions， stabilize and improve the body's immune system.

【Key words】" "Hawthorn extract; High-temperature; Organ index; T lymphocytes

高溫作業人員長期處于高溫環境中進行勞動，會影響機體的免疫系統，并誘發多種免疫性疾病[1]。有研究表明高溫下機體內環境的紊亂可造成免疫器官萎縮，影響T淋巴細胞的成熟，降低細胞免疫功能，輔助性T細胞的缺失也會導致體液免疫功能減弱[2]。山楂提取物是一種藥食兩用的藥物，其中所含的黃酮類化合物可以顯著調節T淋巴細胞，減輕機體免疫系統受到環境影響的程度[3]。有研究總結了山楂中多酚類化合物對機體的作用，表示山楂多酚在免疫治療方面效果明顯，具有很大的研究潛力[4]。山楂提取物對機體在長期高溫和運動條件下的T淋巴細胞有哪些影響，有待進一步探索。本研究通過建立大鼠高溫環境下跑臺運動模型，模擬高溫工作人群的現狀[5]，觀察大鼠血液T淋巴細胞水平變化，從器官和細胞水平探討山楂提取物對高溫環境下大鼠的T淋巴細胞亞群的作用，現將結果報告如下。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑與儀器

山楂提取物（西安匯林生物科技有限公司），T淋巴亞群抗體試劑盒（聯科生物技術開發公司Anti-Rat），動物實驗跑臺（淮北正華生物儀器設備公司ZH-PT），流式細胞儀（美國BD公司AccuriC6），濕球黑球溫度系數儀（美國QUEST公司QT-32），高速離心機（德國Eppendorf公司5425R）。

1.2" 試驗動物及分組

24只SPF級的6w齡雄性SD大鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。大鼠適應性喂養1w后，隨機選取6只，作為常溫運動對照組；隨機選取6只，作為高溫運動模型組，剩余大鼠隨機分為數量相同的兩組，分別為高溫運動補充低劑量山楂提取物組簡稱為高溫低劑量組6只和高溫運動補充高劑量山楂提取物組簡稱為高溫高劑量組6只。

1.3" 動物模型構建

大鼠飼養在實驗動物飼養柜（溫度：22±2℃，濕度：50%～60%），自由飲食。大鼠用普通飼料（中國遼寧長生生物）按GB 14924.3-2010實驗動物-配合飼料營養成分喂食。所有動物實驗操作程序符合學校實驗動物倫理委員會要求，符合3R原則。高溫組的溫度設置參照高溫作業分級中的重度危害作業溫度（GBZ/T 229.3-2010），高溫溫度用鹵素管加熱，熱系數測定儀測量濕球黑球溫度（wet bulb globe temperature，WBGT）系數33±2℃。大鼠運動的設定依據Bedford動物跑臺訓練實驗理論[6]，設定跑臺傾角15°，轉速為14rpm，上、下午各運動30min，每天1h，共4w。補充劑組每天進行山楂提取物補充劑干預；對照組予以等體積的蒸餾水。實驗過程中，每天記錄采食量，每周稱量大鼠體質量。

1.4" 干預劑量計算

采用人與動物體表面積法來換算高溫作業工人與實驗大鼠的等效劑量[7-8]。參照DRIs中原花青素的UL800mg/d[9]，根據資料得知鋼鐵高溫作業工人的平均身高為175.3cm，平均體重為78.5kg[10]，計算出大鼠的黃酮類化合物最大耐受劑量為62.77mg/kg。按照山楂提取物中的黃酮類含量40.21%，計算得出大鼠每天山楂提取物灌胃劑量不超過156.1mg/kg。按照大鼠山楂提取物的最大耐受劑量，將156mg/kg作為每日灌胃高劑量，取其量的一半78mg/kg作為每日灌胃低劑量。

1.5" 樣品采集與處理

補充劑干預4w后，將大鼠麻醉，取胸腺、肝臟、脾臟組織，稱重，計算臟器系數。臟器系數=[臟器質量（g）/體質量（g）]×100%[11]。用流式細胞儀檢測外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細胞含量。

1.6" 數據分析處理方法

整理實驗記錄，建立數據庫。采用SPSS 27.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用“±s”表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較使用LSD法檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 四組大鼠體質量比較

四組大鼠跑臺實驗前體質量比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），跑臺實驗后，四組大鼠體質量差異有統計學意義（Plt;0.05），其中常溫運動組最高，高溫運動組次之，高溫低劑量組最低，見表1。

2.2" 四組大鼠胸腺系數、肝臟系數及脾臟系數比較

四組大鼠胸腺系數、肝臟系數、脾臟系數比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）；兩兩比較顯示，高溫低劑量組大鼠胸腺系數、肝臟系數高于高溫運動組及高溫高劑量組；高溫低劑量組大鼠脾臟系數高于高溫運動組及高溫高劑量組；差異均有統計學意義（Plt;0.05），并且高溫高劑量組脾臟系數高于高溫運動組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。見表2。

2.3" 大鼠血液T細胞亞群

四組大鼠血液T細胞亞群比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。兩兩比較顯示，常溫運動組大鼠血液CD3＋、CD4＋T細胞百分比及CD4＋/CD8＋高于高溫運動組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；高溫低劑量組大鼠血液CD4＋T細胞百分比高于高溫運動組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD3＋、CD4＋T細胞百分比高于高溫運動組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD8＋T細胞百分比高于高溫運動組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD4＋/CD8＋高于高溫運動組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD3＋、CD4＋、CD8＋T細胞百分比高于高溫低劑量組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。見表3。

3" 討論

在高溫環境下工作的工人會出現熱應激，造成內環境紊亂，引起特異性或非特異性反應，直接或間接地損害人體的免疫系統[12-13]。山楂含有豐富的植物化學物質，其提取物中所含的黃酮類物質具有天然地生物活性，為改善高溫環境下機體免疫系統功能的研究提供了物質來源基礎[14]。本研究從免疫器官、免疫細胞進行不同層面的分析探究山楂提取物調節機體免疫的機制，并通過設置高溫運動的環境條件，為研究營養干預下特殊環境作業人群的免疫調節提供參考。

免疫器官的重量在一定程度上可反映免疫器官內淋巴細胞的數量。脾臟作為外周免疫器官，可以儲存、增殖淋巴細胞和分泌多種抗體和細胞因子，參與機體特異性和非特異性免疫[15]。脾臟系數的降低，不僅直接說明免疫功能的降低，也間接說明淋巴細胞和巨噬細胞等免疫活性細胞數量減少，從而可以間接了解體內淋巴細胞總體水平[15]。有研究通過對小鼠灌胃不同含量的沙蔥黃酮，檢測小鼠免疫器官系數的變化，結果顯示高劑量沙蔥黃酮顯著提高小鼠的脾臟系數[16]。本研究中，與高溫運動組比較，高溫運動劑量組脾臟系數顯著提高，說明補充山楂提取物可以提高外周免疫器官的活性。而與山楂補充劑高溫低劑量運動組比較，山楂補充劑高溫高劑量運動組脾臟系數明顯降低，表示補充劑劑量過大會導致外周免疫器官活性受到抑制。

T淋巴細胞在臨床上是判斷細胞免疫功能的重要指標，其功能取決于T淋巴細胞總值（CD3＋）及其亞群（CD4＋、CD8＋）的相對組成。正常情況下，亞群間互相拮抗達到平衡；當免疫失衡，細胞數及比值發生紊亂，則易引發疾病。當CD4＋/CD8＋的值約為2時，表示機體的免疫系統保持在穩定狀態。如果該比值偏離穩態過高或過低，則意味著免疫系統功能和身體的易感性增強[17]。研究顯示[17]，與安靜時相比，長期高溫運動后即刻檢測顯示受試者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋以及CD4＋/CD8＋的值均有不同程度的降低。有研究進行了體外實驗，在黃酮類化合物原花青素刺激下，脾細胞CD4＋、CD8＋T細胞亞群數量增加，且活化了輔助性T細胞相關細胞因子的表達，證明原花青素可以調節免疫系統活性[18]。在本研究中，隨著攝入山楂提取物劑量的不同，大鼠T淋巴細胞亞群有相關變化，表現為與補充低劑量山楂提取物比較，補充高劑量可以使大鼠T淋巴細胞亞群占比提高，且CD4＋/CD8＋升高到接近常溫運動時的水平，說明山楂提取物對免疫紊亂下的大鼠有調節作用，有助于免疫系統的穩定。

4" 參考文獻

[1] Presbitero A，Melnikov Valentin R，Krzhizhanovskaya Valeria V，et al.A unifying model to estimate the effect of heat stress in the human innate immunity during physical activities[J].Sci Rep，2021，11（1）：16688.

[2] 周京江.熱應激及運動對大鼠CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞水平的影響及其機制的研究[D].北京：中國人民解放軍醫學院，2015.

[3] 史曉龍.金釵石斛等3種藥用植物的化學成分與免疫調節活性[D].昆明：云南大學，2021.

[4] Mehdadi Z，Hamdaoui M，Latreche A.Evaluation of parietal polysaccharides and polyphenols of crataegus monogyna jacq and valorization prospects[C].Kuala Lumpur，Malaysia： Int Inst Chem Biol Environ Eng，2015.

[5] Sareh H，Tulapurkar M E，Shah N G，et al.Response of mice to continuous 5-day passive hyperthermia resembles human heat acclimation[J].Cell Stress Chaperones，2011，16（3）：297-307.

[6] Poole D C，Copp S W，Colburn T D，et al.Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol.2020，318（5）：H1100-H1138.

[7] 魏偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學[M].第4版.北京：人民衛生出版社，2010：870-880.

[8] 黃欣欣.大果山楂黃酮類物質的提取及其抗氧化性和降血脂功能研究[D].南寧：廣西大學，2016.

[9] 孫長顥.營養與食品衛生學第8版[M].北京：人民衛生出版社，2017：121-122.

[10] Yong-Mei T，Dao-Gang W，Jun L，et al.Relationships between micronutrient losses in sweat and blood pressure among heat-exposed steelworkers[J].Ind Health，2016，54（3）：215-223.

[11] Qiang F，Yan H，Bian L，et al.Organ index of immunological and anti-tumor effect of intratumor injection of penicillin sodium combined with chemotherapy drug for tumor-bearing mice.[J].J Clin Exp Oncol，2020（15）：34-38.

[12] 李小媛.高溫對多系統損傷的研究現況[J].職業與健康，2017，33（8）：1149-1152.

[13] Jafari M J，Farhang S，Pirposhteh E A，et al.Relationship between heat stress exposure and some immunological parameters among foundry workers[J].Int J Biometeorol，2020，64（5）：853-861.

[14] Li R，Luan F，Zhao Y，et al.Crataegus pinnatifida：A botanical，ethnopharmacological，phytochemical，and pharmacological overview[J].J Ethnopharmacol.2023.301：115819.

[15] Du K，Wang L，Wang Z，et al.Angelica sinensis polysaccharide antagonizes 5-Fluorouracil-induced spleen injury and dysfunction by suppressing oxidative stress and apoptosis[J].Biomed Pharmacother.2023，162（6）：114602.

[16] 劉玉蓉，敖長金，張艷梅，等.不同組分沙蔥黃酮對小鼠的免疫調節作用[J].中國畜牧雜志，2023，59（02）：304-307，313.

[17] 陳小瓊，肖國強.長期高溫預處理對力竭運動后T淋巴細胞亞群的影響[J].體育學刊，2010，17（10）：109-112.

[18] Ying-zi L，Yong-guo C，Jun-qing Y，et al.Immunomodulatory effects of proanthocyanidin A-1 derived in vitro from Rhododendron spiciferum.Fitoterapia.2010，81（2）：108-114.

[2023-05-26收稿]