香煙煙霧提取物對大鼠肺成纖維細胞生長的影響

【摘要】" 目的" 通過觀察不同濃度的香煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）對正常及肺纖維化大鼠肺成纖維細胞的影響，探討香煙煙霧與肺纖維化的可能關系。方法" 體外培養的正常及博萊霉素造模的肺纖維化大鼠的肺成纖維細胞，分別以不同濃度（25％、50％、100％）的CSE作用12h和24h。噻唑藍還原法（MTT法）檢測吸光值；流式細胞儀法觀察細胞壞死與凋亡情況及細胞周期S期（DNA合成期）和G1期（DNA合成前期）的比值。結果" 高濃度（100％）的CSE主要引起兩種大鼠肺成纖維細胞的壞死。較低濃度（25％、50％）的CSE對正常大鼠肺成纖維細胞無明顯影響（Pgt;0.05）。較低濃度（25％、50％）的CSE作用于造模大鼠肺成纖維細胞12h及24h后，吸光值較對照組顯著增高（Plt;0.05），且與時間和濃度有相關性（Plt;0.05）。進一步檢測細胞周期顯示S期/G1期的比值增高（Plt;0.05）。結論" 高濃度的CSE會引起肺成纖維細胞的壞死。一定濃度范圍內的CSE對纖維化大鼠肺成纖維細胞能通過促進細胞進入S期而具有促進增殖作用，且與時間和濃度呈正相關性，而對正常大鼠肺成纖維細胞無明顯影響。提示香煙煙霧可以促進肺纖維化。

【關鍵詞】" 香煙煙霧；肺成纖維細胞；肺纖維化

中圖分類號" R563;R-332" " 文獻標識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）24--04

香煙煙霧是有眾多化學成分的復雜混合物，超過6000種成分，會對肺臟和全身產生有害影響。吸煙已被公認與多種肺部疾病的發生發展有關，吸煙是肺癌的主要病因，也是慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病的主要危險因素。如今，吸煙還被認為與某些間質性肺病及肺纖維化有關[1]，但尚不清楚吸煙引起間質性肺病的發病機制，對吸煙與肺纖維化關系的研究也很少。為此本研究利用體外培養的正常大鼠及肺纖維化大鼠的肺成纖維細胞，觀察不同濃度香煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）對兩種細胞的影響，探討香煙煙霧在肺纖維化中所起的作用。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

1.1.1" 主要試劑" 博來霉素購自天津太河制藥有限公司；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國GIBCO公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；兔抗大鼠波動蛋白、纖維粘連蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司、第二抗體為羊抗兔IgG購自美國Jackson公司；化學試劑購自美國Sigma公司。

1.1.2" 儀器" 二氧化碳培養箱（美國FORMA公司3112A型）；超凈工作臺、低溫冰箱（日本SANYO公司）；流式細胞儀（美國BD公司FACScan型）；倒置顯微鏡、高速離心機、細胞培養皿及細胞培養瓶（丹麥NUUC公司）。

1.1.3" 香煙" 為南京卷煙廠生產的南京牌高級過濾嘴香煙。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 動物造模" 選取SPF級雄性SD大鼠（由南京市鼓樓醫院實驗動物中心提供）20只，體重180±20g，隨機分為對照組、造模組，每組10只。對照組：氣管內一次性注入等滲鹽水2ml/kg；造模組：在氣管內一次性注射博來霉素5mg/kg。兩組老鼠均于造模后28天通過腹主動脈放血法處死，無菌條件下取出肺組織。所有大鼠右肺上葉留作組織病理切片，中性甲醛固定的右肺上葉，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅（HE）染色評價肺組織病理變化，評定造模效果。其余肺組織留作肺成纖維細胞原代培養。

1.2.2" 大鼠肺成纖維細胞鑒定" 將傳代的肺成纖維細胞接種于置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片的6孔板內，培養箱常規培養。當細胞鋪滿蓋玻片時，取出蓋玻片。用4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗3次。按免疫組化SABC法檢測肺成纖維細胞波動蛋白、纖維粘連蛋白、α-SMA的表達。

1.2.3" CSE的制備" 將香煙置于三通管一端，用50ml注射器通過三通管的另一端抽吸，滿50ml后將煙霧通過三通管第三端注入裝有100mlRPMI-1640無血清培養基的玻璃瓶內，輕輕振蕩，使煙霧完全溶解。如此抽吸二管共100ml香煙煙霧。在超凈臺內經0.22μm微孔濾膜濾過后作為濃度為100%的CSE原液。并配成25%、50%的CSE溶液備用。

1.2.4" 噻唑藍還原法（MTT法）細胞增值檢測" 根據實驗設計分組，對照組分為：①正常細胞12h組；②正常細胞24h組。造模組分為：①造模細胞12h組；②造模細胞24h組。每組設0%CSE組、25%CSE組、50%CSE組、100%CSE組，每組6個復孔。上述試驗條件經過多次預試驗篩選確定。將對數生長期的肺成纖維細胞以1×105/ml的密度接種于96孔板，每孔100μl，培養24h后加入無血清培養液同步化，吸去上清。空白對照細胞加入無血清培養液，其他細胞加入相應的CSE，置于5%CO2、37℃培養箱，培養相應時間（12h或24h）后，每孔加10μl MTT，繼續培養4h，吸去MTT，每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分振蕩溶解。以測量波長570nm，參考波長630nm檢測各孔吸光值。

1.2.5" 流式細胞儀法測定細胞凋亡及壞死率" 將對數生長期的肺成纖維細胞以1×105/ml的密度接種于6孔板，每孔1ml，培養24h后加入無血清培養液使細胞同步化，吸去上清后加入等體積100%CSE或無血清培養液，培養12h后收集細胞，按ANNEXIN-V-FITC凋亡檢測試劑盒說明處理細胞后上機檢測。

1.2.6" 流式細胞儀法檢測細胞周期" 同樣方法處理及收集細胞后，將收集的細胞懸浮于4℃預冷的PBS中，緩慢加入70%預冷乙醇懸浮固定細胞，4℃過夜。檢測前用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，每一樣本中加100 td RNase，37℃中孵育15分鐘，再加200td碘化丙啶，室溫下避光5分鐘后上機檢測。

1.3" 數據分析處理方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用“±s”表示，多組均數比較采用方差分析，方差分析后的兩兩比較以LSD檢驗；計數資料計算百分率，組間率的比較用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

3.1" 造模效果

對照組大鼠肺組織呈粉紅色，有彈性，表面光滑。肺纖維化造模組大鼠肺組織顏色灰暗，硬度增加，表面不平，體積較正常組小。鏡下正常組大鼠肺組織結構無破壞，肺泡腔大小均勻、完整，腔內無滲出。肺纖維化造模組大鼠肺組織見肺泡腔變小，肺泡結構破壞，肺泡間隔顯著增厚，炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增多，膠原增生，符合纖維化肺組織鏡下改變。

3.2" 細胞鑒定結果

免疫組化染色陽性信號均為棕黃色顆粒，定位于胞漿。可見對照組肺組織成纖維細胞呈纖維粘連蛋白、波動蛋白陽性，肺纖維化造模組細胞除纖維粘連蛋白、波動蛋白陽性外，α-SMA染色明顯增強并持續表達，分為：正常組陰性對照、正常細胞組、造模組陰性對照、造模細胞組。見圖1。

3.3" 不同濃度CSE對體外培養大鼠肺成纖維細胞的影響

方差分析后的兩兩比較結果顯示，25%、50%CSE作用于正常大鼠肺成纖維細胞12h和24h后測定的吸光度值與0%CSE組比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。而25%、50%的CSE作用于造模組大鼠肺成纖維細胞用12h及24h后測定的吸光度與對照組相比明顯增高，差異有統計學意義（Plt;0.05）。100%CES作用于正常大鼠及造模大鼠肺成纖維細胞12h及24h后吸光度與對照組相比均顯著降低（P=0.001，P=0.008）。提示一定濃度的CSE對纖維化大鼠肺成纖維細胞具有促進增殖的作用，而且在一定范圍內與時間和濃度呈正相關，但對正常大鼠肺成纖維細胞則無此種影響；高濃度CSE則對所有肺成纖維細胞均有明顯抑制生長的作用。見表1。

3.4" 高濃度的CSE對大鼠肺成纖維細胞凋亡及壞死的影響

使用100%CSE作用于正常及肺纖維化造模大鼠肺成纖維細胞12h后，分別測定細胞的凋亡率和壞死率。四組大鼠凋亡率比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），四組大鼠壞死率比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），提示高濃度CSE抑制肺成纖維細胞增長是通過導致肺成纖維細胞壞死實現的，見表2。

3.5" CSE對造模大鼠肺成纖維細胞細胞周期的影響

用25%CSE作用于造模大鼠肺成纖維細胞12h及24h后測定細胞周期。結果顯示：細胞周期S期/G1期的比值與對照組比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。提示一定濃度的CSE促進肺成纖維細胞增殖主要通過促進細胞由G1期（DNA合成前期）進入S期（DNA合成期）導致。見表3。

4" 討論

肺纖維化的發病機理，目前尚不完全明確。一般認為其發病機制包括肺泡上皮的損傷，成纖維細胞灶的形成以及細胞外基質的過度沉積，最終導致肺纖維化的形成[2]。早在70年代，就有實驗用狗證實了香煙能夠引起肺纖維化[3]。之后，也有很多關于吸煙與肺纖維化的研究。但這些研究主要關注吸煙通過各種機制引起肺泡上皮損傷[4]，關于吸煙對肺成纖維細胞影響的研究不多。

而最新的觀點認為，成纖維細胞灶主要由表達α-SMA的肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）構成，可能是MFB凋亡受抑制或持續增殖所致[5]。經氣管注入博萊霉素是復制肺纖維化動物模型的經典方法并得到不斷的研究和改進[6-7]。同時借鑒Zhang等[8]用博萊霉素復制大鼠肺纖維化模型后，觀察到了大量高度表達α-SMA的細胞形成的結論。本實驗用氣管內注射博來霉素的的方法復制大鼠肺纖維化模型。通過病理學證實了誘導大鼠肺纖維化成功。且隨后進一步細胞免疫組化顯示，造模組大鼠肺成纖維細胞與正常大鼠肺成纖維細胞相比，α-SMA染色明顯增強并持續表達，和Zhang等[8]的結果相似，說明博來霉素誘導大鼠肺成纖維細胞向MFB轉分化，體外培養的博來霉素造模的大鼠肺成纖維細胞具有MFB表型特點。運用體外培養的這兩種有不同表型特點的大鼠肺成纖維細胞，觀察不同濃度CSE對它們的影響，探討香煙煙霧與肺纖維化的關系。

研究顯示，在體外，高濃度的香煙煙霧提取物對肺泡上皮細胞有毒性作用，能夠引起細胞壞死[9]。本實驗進一步證實了高濃度香煙煙霧同樣能引起肺成纖維細胞壞死。100％的CSE對兩種大鼠肺成纖維細胞生長均有顯著抑制作用，且進一步的流式細胞學檢測發現這種抑制作用主要通過引起細胞壞死而并不是細胞凋亡實現的。

國外的研究同時還提示低濃度CSE可抑制肺成纖維細胞的修復和增殖，誘導凋亡。而更低濃度的CSE雖引起了肺成纖維細胞DNA破壞，但并未引起細胞凋亡，且當去除CSE暴露后細胞得到修復并能重啟增殖[10]。本實驗參考和改進國外試驗方法，通過一系列預試驗，配制了合適的低濃度的CSE，結果顯示，合適的實驗濃度CSE對正常大鼠肺成纖維細胞沒有明顯造成促進或抑制生長的作用。且該濃度的CSE能被用來進一步用于肺成纖維細胞生長影響的研究。

國內外較多研究香煙和博萊霉素對豚鼠肺纖維化的影響時發現，接受博萊霉素和香煙煙霧聯合處理的豚鼠較單用博萊霉素誘導的豚鼠，具有更廣泛的纖維化損傷和更明顯的α-SMA表達[11-12]。本實驗顯示，合適濃度的CSE對纖維化大鼠肺成纖維細胞具有促進增殖的作用，而且在一定范圍內與時間和濃度有相關性。通過進一步的細胞周期檢測顯示，這種促進增殖的作用主要表現為促進大鼠肺成纖維細胞由G1期（DNA合成前期）進入S期（DNA合成期）。

合適濃度的CSE對兩種不同表型特點的大鼠肺成纖維細胞有不同作用的原因，可能是由于MFB與普通的成纖維細胞相比，具有強大的合成分泌功能，能產生多種細胞因子，包括轉化生長因子-β1（TGF-β1）、血小板源性生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等[13]。

國內外的研究證實[14]，用氧化的胱氨酸、半胱氨酸作用于肺成纖維細胞后發現，細胞外的氧化應激反應能通過TGF-β1的上游調控而引起肺成纖維細胞增殖；在香煙煙霧處理的豚鼠肺泡灌洗液中IL-4等炎癥因子明顯增高；從牛分離得到的肌成纖維細胞進行體外培養，觀察到PDGF、bFGF對肌成纖維細胞具有促進增殖的作用，且在有IL-4共同作用下，這種增殖作用增加了2倍以上。綜合以上研究推測，合適濃度的CSE可能正是通過香煙煙霧中的多種氧化物質和造模細胞產生的TGF-β1，促進纖維化大鼠肺成纖維細胞增殖。以此推斷，吸煙行為下，香煙煙霧也可能通過誘導和促進纖維化大鼠肺成纖維細胞分泌IL-4、PDGF-BB、bFGF等多種細胞因子，并通過這些細胞因子的聯合作用而引起肺成纖維細胞增殖。

本實驗通過制備合適濃度的CSE，作用于正常大鼠和肺纖維化大鼠的肺成纖維細胞，觀察兩種肺成纖維細胞生長情況。結果顯示：一定濃度的香煙煙霧提取物對正常大鼠肺成纖維細胞無明顯影響，而能促進肺纖維化大鼠肺成纖維細胞增殖，且在一定范圍內與時間和濃度呈正相關。這個結果可能可以提示，吸煙者長期大量吸入香煙煙霧可以通過引起肌成纖維細胞增殖而促進肺纖維化，引起間質性肺病。但由于該實驗僅僅是動物及細胞實驗，對于吸煙引起肺纖維化的發病機制仍需要進一步研究。

5" 參考文獻

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[2023-07-18收稿]