補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠行為學及腦組織能量代謝和線粒體的影響

【摘要】" 目的" 通過動物試驗，探討補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠行為學及腦組織能量代謝和線粒體功能的影響。方法" 應用90只健康雄性小鼠，分為模型組、陽性對照藥組（鹽酸多奈哌齊0.45mg/kg）、大劑量組（補陽還五湯37.06g/kg）、中劑量組（補陽還五湯18.53g/kg）、小劑量組（補陽還五湯9.26g/kg）以及假手術組（灌服同體積生理鹽水），每組各15只小鼠。進行行為學測試和腦組織能量代謝及線粒體形態檢測。結果" 在定位巡航試驗中，補陽還五湯組（3個劑量組）小鼠的逃避潛伏期比模型組更短，平均游泳距離比模型組更低，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。在空間探索試驗中，補陽還五湯組小鼠的穿越平臺區次數比模型組更多，目標象限停留時間比模型組更長，相對象限停留時間比模型組更短，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。在跳臺試驗中，補陽還五湯組小鼠的停留潛伏期比模型組更短，錯誤次數比模型組更少，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。補陽還五湯組小鼠的三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸肌酸（PCr）比模型組更高。在改善線粒體功能方面，補陽還五湯組小鼠的線粒體A250光吸收值、線粒體膜電位比模型組更高，差異有統計學意義（Plt;0.05）。上述試驗中，補陽還五湯大劑量組小鼠的檢測結果均優于中劑量組和小劑量組（Plt;0.05）。結論" 補陽還五湯能夠改善AD模型小鼠的學習和記憶能力，改善腦組織能力代謝及線粒體功能，具有治療AD的作用。

【關鍵詞】" 補陽還五湯；阿爾茨海默病；CREB/PGC-1α通路；線粒體功能

中圖分類號" R285.5" " 文獻標識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）10--04

阿爾茨海默病（AD）是一種復雜、難治的神經系統退行性疾病，智能衰退是該病的主要特征。病情的持續進展會加重患者的記憶、認知功能損害，同時還會產生異常的情感行為表現，重癥患者完全喪失自理能力[1]。AD具體病因及發病機制不詳，目前主要采用藥物治療，常規應用鹽酸多奈哌齊，用于增強膽堿能的神經功能，進而改善患者的認知障礙，可以在一定程度上延緩病情進展[2]，但尚無治愈該病的方法。中醫認為AD屬于“呆癥”“癡呆”范疇，與患者的腎虛髓虧、氣虛血瘀、腦失濡養等病機有關，應用具有補氣活血通絡功效的補陽還五湯方劑進行治療[3]。為了解補陽還五湯對AD的治療作用機制，本研究通過動物試驗，分析補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠行為學及腦組織能量代謝和線粒體功能的影響，結果報告如下。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

（1）試驗動物：健康雄性小鼠90只，周齡5～10周；體重18～25g，平均21.08±2.02g。

（2）試驗藥物：補陽還五湯（黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、地龍、紅花、桃仁七味中藥，生藥用量按40∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1比例制備水煎劑），選擇鹽酸多奈哌齊（陜西方舟制藥有限公司，國藥準字H20030582）作為陽性對照藥，溶于生理鹽水，形成0.1mg/ml溶液。

（3）試劑：Aβ1-42（上海拜力生物科技有限公司）。

（4）試驗儀器：SMARTWM Morris水迷宮（北京友誠嘉業生物科技有限公司），stoelting51700全自動腦立體定位儀（上海軟隆科技發展有限公司），DT-200小鼠跳臺測試儀（上海康為醫療科技發展有限公司），DB011型避暗試驗視頻分析系統（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司）。

1.2" 動物造模及分組處理

在動物造模的過程中，將小鼠麻醉，經過消毒后。切開小鼠頭頂正中位置，形成縱向切口。在前鹵向后1.4mm、向右1.4mm的位置，進行打孔操作，將微量進樣器插入，在側腦室注入Aβ1-42溶液2μl 或無菌生理鹽水2μl。其中75只小鼠注射Aβ1-42溶液，另外15只小鼠注射無菌生理鹽水（假手術組）。完成動物造模后，飼養小鼠7d。將90只小鼠分為6組，包括模型組、陽性對照藥組（鹽酸多奈哌齊0.45mg/kg）、補陽還五湯大劑量組（37.06g/kg）、補陽還五湯中劑量組（18.53g/kg）、補陽還五湯小劑量組（9.26g/kg）各15只以及假手術組（灌服同體積生理鹽水）15只。持續給藥30d后，進行試驗。

1.3" 試驗檢測方法

1.3.1" 行為學測試" 在水迷宮試驗中，先進行預訓練，將小鼠放入水中后，引導其尋找平臺，共訓練1d（3次/d）。經過預訓練后，先后進行定位巡航試驗、空間探索試驗、跳臺試驗。根據以上行為學測試結果，對小鼠的學習記憶能力進行評價。

1.3.2" 腦組織線粒體功能及能量代謝指標檢測

（1）將線粒體分離緩沖液預冷處理后，對小鼠腦組織進行沖洗，剪碎后轉移，形成勻漿液，進行離心處理，取上清液。應用線粒體分離緩沖液，對沉淀進行處理，使其重懸。將勻漿液離心處理后，取上清液。將2次獲取的上清液混合，再進行離心處理，分離上清液（胞質組分）與沉淀（線粒體粗提物）。將沉淀置入Percoll溶液（15%濃度），重懸后，轉移至Percoll溶液（25%濃度和40%濃度）。離心處理后，獲取純化線粒體，提取后，加入線粒體儲存緩沖液（蔗糖+甘露醇+EGTA+HEPES），離心處理后，將沉淀置于線粒體儲存緩沖液中重懸。

（2）應用純化線粒體溶解液進行處理后，線粒體提取物被溶解，針對該過程中產生的可溶性蛋白進行測定。然后應用相關試劑盒，對線粒體的純度、腫脹度、膜電位、呼吸鏈復合物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）活性、三羧酸酸循環關鍵酶（丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶等）進行測定，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3" "SOD、MDA、GSH-PX活性的測定" "取小鼠腦組織，經過裂解處理后，形成勻漿，經離心處理后，取上清液，應用試劑盒，進行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的測定。

1.4" 觀察指標

（1）定位巡航試驗指標：在水迷宮試驗中，先進行預訓練，將小鼠放入水中后，引導其尋找平臺，共訓練1d（3次/d）。經過預訓練后，進行定位巡航試驗。提升水位，使其高于平臺（第1象限中央）0.5cm左右。在目標象限之外，將小鼠放入水中，記錄其找到平臺的時間，為逃避潛伏期，檢測小鼠的游泳距離，共訓練5d（2次/d），計算平均值。

（2）空間探索試驗指標：在水迷宮中，將平臺撤出后，在目標象限之外，將小鼠放入水中，觀察大鼠在水中游泳情況。在120s內，對于小鼠的空間探索情況進行觀察，記錄其在各象限的停留時間、路程等，共訓練1d。降低水迷宮中水面高度，使其低于平臺1cm左右，在目標象限之外，將小鼠放入水中，記錄其找到平臺的時間（逃避潛伏期），共訓練1d。

（3）跳臺試驗指標：在小鼠離開跳臺后，會接觸通電的銅柵，記錄小鼠接觸銅柵的次數以及在跳臺上的停留時間，共訓練2d。然后應用避暗試驗視頻分析系統，在暗室內通電，小鼠進入暗室時，會受到電擊，記錄大鼠受到電擊的次數。

（4）腦勻漿液相關指標：將小鼠殺死，取出腦組織，加入生理鹽水，形成腦勻漿液（20%濃度）。在腦勻漿液中加入0.5ml高氯酸（4%濃度），經過離心處理后，取上清液。混合KOH溶液（20%濃度），應用高效液相色譜（HPLC），測定三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷（AMP）、磷酸肌酸（PCr）水平。

（5）線粒體腫脹度、線粒體膜電位：取線粒體提取物（含50mg蛋白），重懸于測定緩沖液，混勻后，在25℃的條件下孵育，應用分光光度計，測定線粒體A250光吸收值。線粒體A250光吸收值越高，說明腫脹度小。取腦組織線粒體，經緩沖液溶解后，混勻離心，加染色混合液，在避光環境中，于37℃條件下孵育，應用酶標儀檢測，測得590nm、530nm熒光強度，根據兩者的比值，分析線粒體膜電位。

1.5" 統計學方法

運用SPSS 21.0統計學軟件處理數據，計量資料用“均數±標準差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 定位巡航試驗結果

相比于模型組，補陽還五湯組（三個劑量組）小鼠在定位巡航試驗中的逃避潛伏期相對更短，平均游泳距離相對更低，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。說明補陽還五湯可以改善模型小鼠的學習巧憶能力，且改善作用與補陽還五湯的劑量成正比。見表1。

2.2" 空間探索試驗結果

相比于模型組，補陽還五湯組（三個劑量組）小鼠在空間探索試驗中的穿越平臺區次數相對更多，目標象限停留時間相對更長，相對象限停留時間相對更短，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。說明補陽還五湯可以提高模型小鼠的空間探索能力，其作用與補陽還五湯的劑量成正比。見表2。

2.3" 跳臺試驗結果

相比于模型組，補陽還五湯組（三個劑量組）小鼠在跳臺試驗中的停留潛伏期相對更短，錯誤次數相對更少，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。說明補陽還五湯可以改善模型小鼠的記憶能力，其作用與補陽還五湯的劑量成正比。見表3。

2.4" 腦勻漿液相關指標測定結果

相比于模型組，補陽還五湯組（三個劑量組）小鼠的ATP、ADP、PCr相對更高，大劑量組AMP相對更低，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。表明補陽還五湯可以改善模型小鼠的腦內能量代謝，其作用與補陽還五湯的劑量成正比。見表4。

2.5" 線粒體腫脹度、線粒體膜電位對比

相比于模型組，補陽還五湯組（三個劑量組）小鼠的線粒體A250光吸收值、線粒體膜電位相對更高，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。表明補陽還五湯可以改善模型小鼠的腦組織線粒體腫脹度及線粒體膜電位，其作用與補陽還五湯的劑量成正比。見表5。

3" 討論

AD的發生，對于老年人的身心健康形成嚴重的危害，隨著病情的進展，患者會出現嚴重的認知功能障礙，生活自理能力也會逐漸降低和喪失，應該及早進行治療[4]。在AD的藥物治療中，選擇具有增強膽堿能神經功能功效的治療藥物，減輕認知功能障礙，延緩病情的持續進展[5]。目前，中醫藥方法開始應用于AD的臨床治療中，補陽還五湯是治療該疾病的常用中藥方劑，通過補氣活血、通經活絡的途徑，達到改善認知功能的效果[6]。為了具體了解補陽還五湯對AD的治療作用，需要結合藥物對于CREB/PGC-1α通路的調節作用進行評價，結合線粒體功能的改善情況做出判斷[7]。相關研究指出，AD的發生和進展，與線粒體能量代謝障礙、動力學異常有關[8-9]。補陽還五湯的應用，可以有效調節CREB/PGC-1α通路，有效抑制線粒體功能和結構的異常改變，減少線粒體功能損傷，恢復正常的腦內能量代謝[10]。本試驗中，補陽還五湯組的AD模型小鼠的學習巧憶能力較模型中明顯改善，并且補陽還五湯組的線粒體功能、腦組織能量代謝均優于模型組。證實了補陽還五湯具有抑制線粒體功能和結構的異常改變，減少線粒體功能損傷，恢復正常的腦內能量代謝的作用。

綜上所述，在AD的治療，補陽還五湯具有良好的應用效果，具有改善AD模型小鼠的行為學指標及線粒體功能的作用。

4" 參考文獻

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[2022-04-13收稿]