血清4 型禽腺病毒的實驗室診斷方法研究進展

鄭洪玲

（遼寧省農業發展服務中心， 遼寧 沈陽 110033）

心包積液綜合征是肉雞的一種嚴重傳染病，其特征是心包囊內積有一種透明的液體，并伴有腎炎和肝炎[1]。血清4 型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）是心包積液綜合征的病原體，該病毒對雞，特別是對3～5 周齡的肉雞具有很強的致病性，可以通過垂直和水平傳播[2]。自1987 年FAdV-4 在巴基斯坦首次暴發以來，該病毒已傳播到亞洲、中南美洲和歐洲一些國家和許多地區，成為過去30 年給家禽業造成嚴重經濟損失的首要原因之一[3]。FAdV-4 感染的主要靶器官是肝臟，臨床上能夠從感染肉雞的肝臟勻漿中分離出該病毒，并能通過多種實驗室診斷方法檢測到。本文對FAdV-4 實驗室診斷技術的研究進展進行了綜述，以期為我國新發FAdV-4 的防控提供理論依據和技術支撐。

1 透射電鏡診斷

臨床中，診斷疑似感染FAdV-4 病例的依據主要是3～6 周齡肉雞突然出現高死亡率，并表現出心包積液、腎炎和肝炎等癥狀和病理變化。透射電鏡的應用，使病毒、細菌、真菌及原生動物的超微結構檢查成為可能，在微生物的診斷中起著至關重要的作用。它利用透射電鏡從疑似感染FAdV-4 肉雞的肝臟勻漿、肝細胞中觀察到離散的病毒顆粒，具有典型腺病毒外觀，六邊形、二十面體、無包膜，直徑約75 nm，從而對疑似病例進行確診，并證實了FAdV-4 是心包積液綜合征的病原體。從受感染動物的血液、體液或組織中分離病毒也是病毒感染診斷的金標準，而原代雞腎、雞胚腎、雞胚肝、雞胚成纖維細胞和QT-35 細胞均可用于FAdV-4 的分離。李喬斌等選用雞肝癌細胞進行FAdV-4 的分離培養，并利用電鏡技術等對分離病毒進行鑒定，結果顯示在電鏡下可觀察到FAdV-4 的細胞培養物有大量病毒粒子的存在[4]。

2 分子生物學診斷技術

目前，限制性內切酶分析、DNA 探針原位雜交、PCR、實時PCR、環介導等溫核酸擴增技術（LMAP）和高分辨率熔解曲線分析（HRM）等分子生物學診斷方法均可用于FAdV-4 的檢測和鑒定[5]。限制性內切酶分析最初用于禽腺病毒分離株的分組和毒株的分型。根據BamH I 和Hind III消化產生的DNA 基因組相似性，將17 株禽腺病毒菌株的11 個血清型分為5 組（A～E）。盡管血清4 型和10 型禽腺病毒之間存在雙向交叉中和作用，但采用Hind III、Dra I、Xba I、Not I、Sfi I、Bgl II、Sma I 和NaeI 的限制性內切酶分析發現差異不大。一些報道稱可以利用原位雜交直接檢測禽腺病毒DNA 與特定探針，但由于該方法操作復雜，還有更方便、可靠的其它診斷方法，因此目前在臨床診斷上的應用并不廣泛。

PCR 方法具有靈敏度高、操作簡單和快速的優點，一直以來是檢測禽腺病毒的主要方法。目前已發表的禽腺病毒PCR 檢測技術的主要靶基因包括腺病毒的六鄰體基因（hexon）的保守基因區（P1，P2）和可變環區域（L1～L4），研究者針對可變區和保守區都設計過引物[6]。利用2 對在保守區雜交的PCR 引物與限制性內切酶分析結合，使PCR 和限制性內切酶分析能夠檢測和區分所有12 株禽腺病毒參考菌株。利用針對hexon 基因可變區域的引物，通過PCR 結合Southern 雜交成功地從印度一例心包積液綜合征病例中檢測到FAdV-4[7]。目前，將hexon 基因的PCR 產物直接測序，所得信息可用于鑒定禽腺病毒及其血清型。Fu 等從臨床診斷為心包積液綜合征的廣東雞中分離出FAdV-4 毒株，并建立了基于hexon 基因的禽腺病毒特異性PCR 檢測方法，能夠快速對死雞的心臟和肝臟組織樣本進行FAdV-4 檢測，并研究其hexon 基因核苷酸序列的異同[8]。此外，Fiber 是禽病毒表面重要的纖突蛋白，能夠編碼型特異性中和、型特異性非中和和亞屬特異性中和表位，因此常被用于檢測禽腺病毒。有人建立了基于Fiber 的PCR-限制性內切酶分析技術，這是一種新的、可靠的方法，可以用來鑒定FAdV-4 分離株[9]。

上述傳統的PCR 方法是臨床快速檢測禽類病毒病原體的一種簡單而敏感的工具，但該技術無法量化病毒載量。為了克服這一缺陷，研究者們進一步報道了使用基于SYBR green 的實時PCR方法來檢測和量化所有禽腺病毒。劉琳等[10]、羅洋洋等[11]、宋玲玲等[12]眾多研究者分別針對Hexon 基因序列設計引物和探針，建立了FAdV-4的TaqMan 探針熒光定量PCR 檢測方法，這些方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，均可用于臨床樣本的檢測。與此同時，研究者還開發了qPCR、巢式 PCR 和LAMP 等靈敏度更高、特異性更強的方法。鐘鳴針對已公布的禽腺病毒全基因序列的高度保守區域設計特異性引物建立了一種FAdV-4 巢式PCR 檢測方法，同時針對FAdV-4 的Hexon 基因序列建立了特異性LAMP檢測方法，并對其反應條件和反應體系進行優化，結果顯示兩種檢測方法中，LAMP 檢測方法的特異性和靈敏性更佳[7]。欒勇嬌設計篩選了兩套LAMP 引物和2 條分子信標探針，建立了鑒別診斷FAdV-4 變異株和非變異株的雙重熒光LAMP檢測方法[5]。如前所述，將PCR 與限制性內切酶分析和/或DNA 測序相結合，可用于基因分型和區分所有12 種禽腺病毒血清型，但這些組合方法相對昂貴和耗時，而且往往需要大量的分析，這就限制了它們作為常規血清分型方法的使用范圍。近年來，高分辨率熔解曲線分析為遺傳變異的直接基因分型提供了一種簡單且成本較低的替代方法。該方法針對禽腺病毒結構蛋白編碼基因hexon的L1 區設計引物HexL1s/HexL1，通過對約590 bp大小的 PCR 產物的熔解曲線分析顯示，熔解曲線具有高度重復性和可區分性，有一個或多個主峰，是一種簡單、靈敏和特異的基因分型和區分所有12 種禽腺病毒血清型的方法。王冬雪建立的PCRHRM 方法對腺病毒實現了準確、快速的基因分型，該方法主要是針對Ⅰ群禽腺病毒進行鑒定[13]，而目前針對FAdV-4 的PCR-HRM 方法還有待進一步探索。

3 血清學技術

目前，間接血凝試驗、間接免疫熒光試驗、瓊脂糖凝膠沉淀試驗、瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗、病毒中和試驗和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等多種血清學技術已用于診斷家禽FAdV-4 感染。最初，基于實驗室制備的高免血清，利用間接免疫熒光試驗、瓊脂糖凝膠沉淀試驗和瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗，在感染后家禽的肝臟或不同組織的勻漿提取液中檢測到FAdV-4。而間接血凝試驗可以用于疫苗接種后的抗體效價檢測，還可用于從被感染的雞中檢測針對FAdV-4的抗體。研究顯示，病毒中和試驗被用于區分禽腺病毒的血清型和評估疫苗誘導產生的抗體反應，是一種敏感性和準確率更高的方法，但病毒中和試驗的缺點是昂貴和耗時，因此，必須在合理的情況和有條件時使用。

近年來，FAdV-4 血清學技術的研究進展主要集中在對ELISA 方法的改進和優化方面。在早期研究中，采用全病毒作為包被抗原的間接ELISA法，被用來檢測自然感染和實驗感染雞的組織樣本中的FAdV-4 抗體，但試驗中病毒抗原的制備相對繁瑣和低效，敏感性和特異性也不是很高。后來，研究人員開發了一種夾心ELISA 方法，用來檢測實驗感染雞的各種組織，包括肝臟、脾臟、法氏囊、胸腺和腎臟中的FAdV-4 抗原[14]；該方法具有較高的靈敏度和特異性，可在較低濃度條件下檢測出FAdV-4 抗原。最近，有研究者利用原核表達系統成功表達和純化了FAdV-4 結構蛋白和非結構蛋白。武小倩[15]、He[16]等分別建立了基于fiber-1和fiber-2 蛋白的FAdV-4 特異性間接ELISA 檢測方法；田開月等針對中國流行株的fiber-2 蛋白進行原核表達后建立了間接ELISA 檢測方法[17]；申秋平建立的ELISA 檢測方法則是基于FAdV-4 的非結構蛋白[18]。這幾種重組蛋白的ELISA 方法具有較高的靈敏度、特異性、準確性和重復性，易于標準化，更適合大規模應用。

4 小結

在感染雞的12 種血清型FAdV 中，FAdV-4是主要的流行株，對肉雞具有較高的致病性，嚴重危害我國的養雞業，帶來的經濟損失近年來也迅速增長。因此，我們應該格外重視該病原的流行病學調查、診斷檢測和防控等工作，而使用快速有效的檢測方法尤為重要。本文提到的瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗、間接免疫熒光分析、酶聯免疫吸附試驗、限制性內切酶分析、聚合酶鏈式反應（PCR）、實時PCR、LAMP 和HRM 等方法，主要歸納為分子生物學和血清學檢測兩類，是目前檢測FAdV-4 感染常用的實驗室診斷方法。研究者根據實際感染情況和試驗條件從中選擇合適的方法，能夠快速檢測禽腺病毒感染，從而為該病的防控贏得時間。